分子生物学(杨洋)第三章-dna的复制-thereplicationofdna

WelcometoMyMolecularBiologyClass,YangYang（杨洋教授）HuazhongUniversityofScienceandTechnology,MolecularBiologyoftheGene,5/E-Watsonetal.(2004),PartI:ChemistryandGeneticsPartII:MaintenanceoftheGenomePartIII:ExpressionoftheGenomePartIV:RegulationPartV:Methods,PartII:MaintenanceoftheGenome,DedicatedtothestructureofDNAandtheprocessesthatpropagate,maintainandalteritfromonecellgenerationtothenext,CHAPTER3:ThereplicationofDNA(DNA的复制）,Therevisedcentraldogma,Translation,RNAprocessing,DNArepair,基因组的保持,基因组的表达,1.TheChemistryofDNASynthesis(DNA合成的化学基础）2.TheMechanismofDNAPolymerase（DNA聚合酶的作用机制）3.TheSpecializationofDNAPolymerases（DNA聚合酶的特化）4.TheReplicationFork（复制叉）5.DNASynthesisattheReplicationFork（复制叉上的DNA合成）6.InitiationofDNAReplication（复制的起始）7.BindingandUnwinding（结合和解旋）8.FinishingReplication（复制的终止）,Outline,ThefirstpartdescribesthebasicchemistryofDNAsynthesisandthefunctionoftheDNApolymerase,1.TheChemistryofDNASynthesis,1DNAsynthesisrequiresdeoxynucleosidetriphosphatesandaprimer:templatejunction（DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物-模板接头）,DNA合成必须具备的两个关键底物：四种脱氧核苷三磷酸-dATP,dGTP,dCTP,dTTP2.引物-模板接头（primer:templatejunction）,SubstratesrequiredforDNAsynthesis,2-脱氧核糖核苷三磷酸,退火引物,DNA的生长末端,模板链,1.2DNAissynthesizedbyextendingthe3endoftheprimer(DNA通过引物3端的延伸进行合成）,DNA合成由掺入dNTP的-磷酸的亲核攻击引发，导致引物3端延伸一个核苷酸，并释放一个焦磷酸,1.3Hydrolysisofpyrophosphate(PPi)isthedrivingforceforDNAsynthesis（焦磷酸水解是DNA合成的驱动力）,2.ThemechanismofDNAPolymerase(Pol)（DNA聚合酶的作用机制）,2.1DNAPoluseasingleactivesitetocatalyzeDNAsynthesis（DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的合成）,AsinglesitetocatalyzetheadditionofanyofthefourdNTPs（DNA聚合酶用一个活性位点来催化任意4种脱氧核苷三磷酸的添加）RecognitionofdifferentdNTPbymonitoringtheabilityofincomingdNTPinformingA-TandG-Cbasepairs（DNA聚合酶监视引入核苷酸形成A-T或G-C碱基对的能力，而不是检测进入活性位点的是何种核苷酸）只有在形成正确碱基对的情况下，引物的3-羟基和在最佳催化位置上的引入核苷三磷酸的-磷酸才能发生催化反应Incorrectbasepairdramaticallylowerstherateofcatalysis（错误核苷酸掺入的速率是碱基配对正确时掺入速率的1/10000）,DistinguishingdifferentdNTPs:kineticselectivity,不正确的A-A碱基配对使引入核苷酸的-磷酸错位，极大地降低了催化速率，导致DNA聚合酶优先添加正确配对的dNTP,DistinguishingbetweenrNTPanddNTPbystericexclusionofrNTPsfromtheactivesite(空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP-核糖核苷三磷酸）DNA聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异的分辨能力虽然细胞中rNTP比dNTP浓度要高10倍，但它们掺入的速率却是dNTP的1/1000,2.2DNAPolresembleahandthatgripstheprimer-templatejunction(DNA聚合酶像手掌一样握住引物-模板接头）,Thumb,Fingers,Palm,DNA聚合酶的3个结构域：拇指，手指，手掌,（拇指）,（手指）,（手掌）,Containstwocatalyticsites,oneforadditionofdNTPsandoneforremovalofthemispaireddNTP.Thepolymerizationsite:(1)bindstotwometalions（Mg2+,Zn2+)thatalterthechemicalenvironmentaroundthecatalyticsiteandleadtothecatalysis（结合2个二价金属离子，可以改变正确碱基配对的dNTP和3-羟基周围的化学环境）(2)Monitorstheaccuracyofbase-pairingforthemostrecentlyaddednucleotides(检查最新加入的碱基配对的准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物-模板接头从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个独立的具有校对功能的核酸酶的活性位点上）3.Exonucleasesite/proofreadingsite（校对功能，外切核酸酶活性位点）,DNAPolymerase-palmdomain(手掌域）,BindstotheincomingdNTP,enclosesthecorrectpaireddNTPtothepositionforcatalysis（手指域中的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦形成正确的碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP）这种闭合形式可以使引入的核苷酸与催化性的金属离子密切接触，从而促进催化反应手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架在活性部位后立即产生约90度的回折。此弯曲仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露,DNAPolymerase-fingerdomain（手指域）,Thumb,Fingers,Palm,（拇指）,（手指）,（手掌）,模板上的弯折,模板碱基,模板,引物,NotdirectlyinvolvedincatalysisInteractswiththesynthesizedDNA（与最新合成的DNA相互作用）maintaincorrectpositionoftheprimerandtheactivesite（维持引物及活性部位的正确位置）maintainastrongassociationbetweenDNAPolanditssubstrate（维持DNA聚合酶与其底物之间的紧密连接）,DNAPolymerase-thumbdomain（拇指域）,2.3DNAPolareprocessiveenzymes（DNA聚合酶是一种延伸酶）,DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力（催化是快速的，每秒添加1000个核苷酸）Processivity（延伸能力）isacharacteristicofenzymesthatoperateonpolymericsubstrates（酶处理多聚体底物的一种特性）TheprocessivityofDNAPolistheaveragenumberofnucleotidesaddedeachtimetheenzymebindsaprimer:templatejunction（DNA聚合酶的延伸能力定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平均数）每个DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结合后时仅几个核苷酸到5000多个碱基,TherateofDNAsynthesisiscloselyrelatedtothepolymeraseprocessivity,becausetherate-limitingstepistheinitialbindingofpolymerasetotheprimer-templatejunction（聚合酶与引物-模板接头的最初结合是限速步骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅速了）高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比，其DNA合成的整体速率可高出1000倍,假设的非延伸性DNA聚合酶,延伸性DNA聚合酶,添加1个dNTP然后释放下来,延伸性的DNA聚合酶与模板结合一次，就能添加很多dNTP,2.4ExonucleasesproofreadnewlysynthesizedDNA（外切核酸酶负责校正新合成的DNA),仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细胞内观察到的极高的DNA合成精确度（约每添加1010个碱基对产生一个错误）影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成“错误”的互变异构体（亚氨基或者烯醇）碱基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。校正作用可以纠正这种错误DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实现的ThemismatcheddNMPisremovedbyproofreadingexonuclease（校正外切核酸酶）,apartoftheDNApolymerase（DNA聚合酶的一部分）,当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3端去除给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会,1.DNA合成缓慢或无DNA合成,错配的最后一个碱基对,外切核酸酶活性位点,2.错配核苷酸的去除,3.重新进行DNA合成,无需DNA脱离聚合酶即可进行校正，引物-模板接头从DNA聚合酶活性位点滑动到外切核酸酶活性位点,当聚合酶把不正确核苷酸掺入DNA后，DNA合成速率降低，引物3端与DNA聚合酶活性位点的亲和力减弱,错配后引物的3端与校正外切核酸酶活性位点的亲和力增加，与此位点结合后错配核苷酸即被除去,当不正确的碱基对被去除后，正确配对的引物-模板接头又滑回到DNA聚合酶活性位点,校正外切核酸酶键盘上的“delete”（删除）键只能将最近发生的错误去除掉校正外切核酸酶极大地增加了DNA合成的精确度，从每添加105个核苷酸插入1个错误碱基降低到每添加107个核苷酸插入1个错误碱基但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率：每添加1010个核苷酸出现1次错误）下一章：复制后的错误修复,3.Thereplicationfork（复制叉）,3.1BothstrandsofDNAaresynthesizedtogetheratthereplicationfork(复制叉上DNA双链的两条链是同时进行复制的),在细胞中，DNA双链的两条链时同时进行复制的，这要求将双螺旋的两条链分开以形成两条DNA模板replicationfork：ThejunctionbetweenthenewlyseparatedtemplatestrandsandtheunreplicatedduplexDNA（刚分开的模板链和未复制的双链DNA之间的连接区称为复制叉),Leadingstrand(前导链）,Laggingstrand（后随链）,Okazakifragment,Replicationfork,已复制DNA,未复制DNA,前导链聚合酶运动方向,后随链聚合酶运动方向,总的DNA复制方向,复制叉向着未复制的DNA双链区域运动，其身后留下指导两个子代DNA双链形成的两条单链DNA模板,DNA的合成只能从53进行（沿着3端进行合成）半不连续复制：两条暴露的模板中只有一条能够随着复制叉的运动进行连续复制，在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随复制叉，此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（Leadingstrand）另一条模板链指导DNA聚合酶在与复制叉移动相反的方向上运动，此模板指导下新合成的DNA链称为后随链（Laggingstrand），此条DNA链必须以不连续方式进行合成在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（Okazakifragment）：细菌中1000-2000个核苷酸，真核生物中100-400个核苷酸冈崎片段被合成出来之后，相互之间很快共价连接成一条连续的完整的新DNA链，因此冈崎片段是DNA复制中短暂的中间产物,半不连续复制模型的提出和证明：冈崎片段（Okazakifragment）的发现,连续复制,半不连续复制,不连续复制,Okazaki选择T4噬菌体的DNA复制作为模型来研究在逐渐缩短脉冲标记时间的情况下，用3H-脱氧胸苷来脉冲标记进行T4噬菌体DNA复制的大肠杆菌2秒钟脉冲标记时间，通过超速离心测定新合成片段的大小,相对于离心管顶部的距离,放射性强度,DNA短片段,DNA长片段,标记时间2秒,标记时间120秒,实验证据,相对于离心管顶部的距离,放射性强度,DNA连接酶基因缺陷的T4噬菌体,标记时间60秒,突变的噬菌体,实验证据,3.2TheinitiationofanewstrandofDNArequireanRNAprimer（DNA新链的起始需要一条RNA引物）,所有DNA聚合酶均需要带有游离3-羟基的引物，不能从头启动新DNA链的合成,DNA新链合成是如何开始的？细胞利用了RNA聚合酶有而DNA聚合酶没有的能力：从头开始合成新RNA链Primase（引物酶）isaspecializedRNApolymerasededicatedtomakingshortRNAprimersonanssDNAtemplate.DonotrequirespecificDNAsequence.（引物酶是一种能在单链DNA模板上制造短RNA引物的特殊的RNA聚合酶，这些引物随后由DNA聚合酶进行延伸）DNAPolcanextendbothRNAandDNAprimersannealedtoDNAtemplate（DNA聚合酶用与DNA模板退火的RNA引物或DNA引物都能够启动合成）,前导链和后随链都需要引物酶来起始DNA的合成。但是引物酶在这两条链上的工作频率却相差极大-why?每条前导链只需要一条RNA引物，相反后随链的不连续合成意味着每个冈崎片段都需要新引物所以后随链的合成需要数百至数千的冈崎片段及其相关RNA引物引物酶不需要特异DNA序列来起始新RNA引物的合成，相反引物酶只有在与其它DNA复制蛋白如DNA解旋酶结合时才被激活引物酶一旦被激活，即用最新暴露的后随链模板合成RNA引物，而这种合成是没有序列特异性的,3.3RNAprimersmustberemovedtocompleteDNAreplication（完成D