14发酵液的预处理和固液分离方法2

发酵液的预处理和固液分离方法,山东农业大学孙中涛,预处理和固液分离的目的：1、分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)。2、除去部分可溶性杂质。3、改变滤液的性质（降低粘度等），以利于后继操作。,总策略：1、胞外产物：应尽可能转移到液相中，常用调pH至酸性或碱性的方法来达到。2、胞内产物：首先收集细胞、破壁，生化物质释放到液相，再分离细胞碎片。3、通常，以含生化物质的液相为出发点，进行后继操作。,一、发酵液的预处理,1、改变液体物理性质，促进固液分离。细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤，由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢，因此，在预处理中应采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮报中固体粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀释、加热等方法降低粘度，以利于过滤。,必要性：,2、发酵液杂质很多，其中影响最大的是高价无机离子和杂蛋白，预处理时，应尽量除去。,高价无机离子危害：在采用离子交换法提炼时，影响树脂的交换容量。,杂蛋白质的危害：离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时，会降低吸附能力，萃取时，易产生乳化。过滤或膜过滤时，使滤速下降，膜受到污染。,(一)、高价无机离子的去除方法,宜加入草酸。草酸溶解度小，用量大时，可用其盐，如草酸钠。草酸钙能促使蛋白质凝固，提高滤液质量。草酸的回收：四环类抗生素废液中，加入硫酸铅，在60下生成草酸铅。后者在90-95下用硫酸分解经过滤、冷却、结晶后可回收草酸。,1、去除钙离子：,2、除去镁离子：加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物：,用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。此法可用于环丝氨酸的提炼。,3、除去铁离子：可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。,（二）、杂蛋白的去除方法,蛋白质等电点多在pH4.0一5.5，此时溶解度最小。但单靠等电点法不能将大部分蛋白质除去。在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、蹂酸盐、过氯酸盐等形成沉淀。在碱性溶液，蛋白质能与一些阳离子，如Ag1+，Cu2+，Zn2+，Fe3+和Pb2+等形成沉淀。,等电点法：,变性蛋白质溶解度较小。最常用方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。但热处理常对原液质量有影响，特别是会使色素增多。只适于热稳定的物质。,热变性法：,应用举例：1、链霉素发酵液，调至酸性(pH3.0)，加热至70，维持l2h，能去除蛋白质，使过滤速度增大10一100倍，滤液粘度可降低1/6。2、柠檬酸发酵液，加热至80C以上，使蛋白质变性凝固，降低发酵液钻度，大大提高过滤速度。,大幅度改变pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围(pH23)或较碱性范围(pH89）使蛋白质凝固，一般以酸性下除去的蛋白质较多。加有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,使蛋白质变性的其它办法：,举例：1、四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质，取得很好的效果。2、枯草杆菌发酵液，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。,利用吸附作用除去蛋白质：,（三）、凝聚和絮凝技术,凝聚：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。,基本概念：,凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤。常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理。,菌体或蛋白质等胶体粒子表面一般都带有电荷，带电原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。通常菌体带负电荷，由于静电作用使带正电荷的粒子被吸附在周围，在界面上形成了双电层。但这些正离子还受到热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在相距胶核表面约一个离子半径的stern平面以内，正离子被紧密柬缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层，在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。,双电层理论：,1、凝聚技术,当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移面(剪切面)在图141中用波纹线表示。,双电层结构的电位：,1、扩散双电层的结构：一旦由于布朗(Brown)运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生电排斥作用，阻止了粒子的聚集。电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大。2、水化层：由于胶粒表面的水化作用，形成了水化层，也能阻碍直接聚集。水化膜主要是伴随胶粒带电而引起，一旦电位降低或消失，水化层也会随之减弱或消失。,胶粒保持分散状态的原因,电位数学表达式：,电位与扩散层厚度和电动电荷密度成正比，而扩散层厚度又与溶液中离子强度有关，因此，对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层厚度，促使电位迅速降低，而且，化合价越高这种影响越显著，当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。,由式(141，2)知：,电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示。使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(毫摩尔升)，称为凝聚价或凝聚值。反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越强。,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序：,常用的凝聚剂电解质有：,凝聚价或凝聚值：,有机高分子聚合物絮凝剂具有长链线状结构，是水溶性聚合物，分子量高达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷，也可以不带电性。它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。,2、絮凝作用,聚丙烯酰胺类衍生物聚苯乙烯类衍生物无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铁盐等。天然有机高分子絮凝剂：多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等。,絮凝剂,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型(含有羧基)和阳离子型(含有胺基)三类。优点：用量少，般以ppm计，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快、种类多，适用范围广。缺点：存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，因此，当用于食品及医药工业时，应谨慎使用，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子聚凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。,聚丙烯酰胺类絮凝剂：,阳离子型高分子絮凝剂对带负电菌体或蛋白质来说，同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用，非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，主要通过分子间引力和氢键产生吸附架桥，常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入无机电解质，使悬浮粒子脱稳而凝聚，然后，再加入絮凝剂。凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。,混凝：,絮凝剂浓度絮凝剂分子量絮凝剂类型溶液的pH搅拌速度和时间助凝剂,影响絮凝效果的因素：,A.絮凝剂浓度浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸附饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。,分子量提高、链增长，可使架桥效果明显，但分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量的选择应适当，,B.高分子絮凝剂分子量,C.溶液pH的变化会影响絮凝剂功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，链节上相邻离子基团间的电排斥作用，使分子链从卷曲状态变为伸展状态，架桥能力提高。,二、发酵液的过滤,发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分，过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清，并且有高的收率，但发酵液往往很难过滤，目前生产中还是一个薄弱环节。,（一）、发酵液的过滤特性和滤饼的重量比阻,发酵液大多数属于非牛顿型液体，滤渣为可压缩性的。衡量过滤特性的主要指标是滤饼的重量比阻rB，表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关。,对于不可压缩性滤饼，比阻值为常数，但对于可压缩性滤饼，rB是操作压力差的函数、一般可用下式表示：,由此可见滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。因此开始过滤时应注意不能很快提高压差，通常靠液柱的自然压差进料，并应缓慢地逐步地升高压力，一般在相当长的时间内，压力差不要超过0.05MPa，最后的压差(不包括榨滤)也不超过0.3一0.4MPa。,恒压下，可压缩性滤饼的比阻值应为常数。如过滤介质的阻力相对较小可以忽略不计，则恒压下的过滤方程式如下：,（二）、影响过滤速度的因素,菌种发酵条件(培养基的组成，未用完培养基的数量，消沫油，发酵周期)。过滤条件：压力等,菌种对过滤速度影响很大。真菌：菌丝粗大，容易过滤，不需特殊处理。滤渣呈紧密饼状物，易从滤布上刮下，可采用鼓式真空过滤机过滤。放线菌：菌丝细而分枝，交织成网络状，还含有很多多糖类物质，粘性强，重量比阻rB值高，过滤困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。细菌：菌体更细小，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。,1、菌种,培养基的组成对过滤速度影响也很大。黄豆粉、花生饼作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难。举例：a、在链霉素发酵液的培养基中，加以黄豆粉代替玉米浆，则比阻值增大0.61.0倍。b、在青霉素发酵的培养基中，加入酵母蛋白，rB值也提高很多。此外，发酵后期加消沫油或剩余大量末用完的培养基都会使过滤困难。,2、培养基,正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌丝自溶前必须放罐，因为细胞自溶后的分解产物很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。,3、发酵时间,（三）、改善过滤性能的方法,对于难过滤的发酵液，必须设法改善过滤性能、降低滤饼的比阻值，以提高过滤速度。改善过滤性能的方法：1、预处理发酵液。等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚和絮凝等方法。2、加入助滤剂，直接在发酵液中形成填充一凝固剂。3、酶解作用,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，滤速增大。常用的助滤剂：硅酸盐粉末(硅藻土）、纸浆、珠光石(即珍珠岩，成分为二氧化硅）。要求：助滤剂必须不吸附或很少吸附生化物质。,1、加入助滤剂,加入方式：1、在滤布上预先铺一层助滤剂(12mm)，采用此种方法，会使滤速降低，但滤液透明度很快增加。2、直接加入发酵液中。助滤剂用量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。,反应剂相互作用，或和溶解性盐发生反应，生成沉淀。能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构。沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮物凝固。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高310倍。,2、加入反应剂,举例：新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充凝固剂。一方面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，熊使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、镁离子。,如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。例如：万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。,3、采用酶制剂分解黏性物质,发酵液染菌后，会含很多细菌菌体，杂质也增多，造成过滤困难。杂菌的种类不同，对过滤的影响也不同。一般染霉菌尚可，染产气杆菌则很难过滤。处理方法：升高温度、增加纯化剂用量、加助滤剂等。举例：四环素染菌发酵液可以采用加温至40一50，增加黄血盐、硫酸锌用量，以正常批号的滤渣作为助滤剂等办法。,4、染菌发酵液的处理方法,（四）、固液分离设备的选择,不同性状的发酵液应选择不同的固液分离设备。常用分离设备：板框压滤机，鼓式真空过滤机和心沉降分离机等。,1、板框压滤机,优点：过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单，价格低，动力消托少等优点。缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括解框、卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。,自动板框过滤机：是一种较新型的压滤设备，板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。,对于菌体较细小、粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。对于难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的滤框以减小滤饼的阻力。另外，也可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时，在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来压札滤饼，将液体挤压出来。,常用技术措施,2、鼓式真空过滤机,鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。而对菌体较细或粘稠的发酵液不太适用。,一种较好的解决办法是