LCMS技术在中药分析的应用

LC-MS技术在中药分析的应用（一）,宋越2007/05,质谱与液质联用技术原理,概念,质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，然后利用不同离子在电场或磁场中运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分离的分析技术。通过所得到的样品的质谱和相关信息，进行定性与定量分析。质谱仪是实现上述分离分析技术,从而测定物质的质量与含量及其结构的仪器。,质谱分析的基本过程,样品的离子化用适当的方法使样品分子转变为气态离子，对于有机化合物，如果在离子化过程中接受了过多的能量，新生成的分子离子(molecularion)会进一步裂解，生成各种碎片离子(fragmentions)。离子的分离、分析、检测。数据采集与处理。,常用术语,质荷比m/z,，是离子的质量和该离子所带静电单位数的比值。基峰与相对强度基峰（basepeak）是质谱图中的最强峰。质谱峰的强度常以相对强度（relativeintensity）衡量。以基峰的强度为100，算出各个质谱峰的相对百分强度。分子离子分子离子是样品分子失去或得到一个电子而形成的。分子离子代表完整的样品分子，是其所有碎片离子的终极前体(ultimateprecursor)。准分子离子取决于化合物的性质和质谱离子化方法及条件，可生成质子化或去质子的分子，即M+H+、M-H及加合物离子，如M+Na+、M+Cl等，这些均为偶电子（evenelectron）离子。同位素峰这是由于有丰度较低的同位素存在而产生的。,质谱仪,质谱仪由以下几部分组成,进样系统,质量过滤器,样品离子化,进样系统,直接进样杆（directinletprobe,DIP）加热贮槽进样器（heatablereservoirinlet）气相色谱/质谱法（gaschromatography/massspectrometry,GC/MS）液相色谱/质谱法（liquidchromatography/massspectrometry,LC/MS）毛细管电泳/质谱法(capillaryelectrophoresischromatography/massspectrometry,CE/MS),LC-ESI/MS进样系统,输注(infusion)注射器泵（syringepump）将样品溶液直接缓慢输入ESI/MS离子源。这种方法简便、快速。缺点是需要相对多的样品（通常将样品配成溶液，样品体积大于10l）；样品中其它物质可能产生干扰；难于实现自动进样分析。流动注射（flowinjection）将样品溶液置于HPLC进样系统，由LC泵缓慢推动溶剂将注入的样品溶液直接输入ESI/MS离子源。这个方法同样简便、快速；样品溶液的用量可很小（如0.1L）；易于实现自动进样分析。缺点是样品中盐和其它成分可能干扰测定；进样过程中样品溶液可能被稀释，从而降低检测限。,离子源,作用使被分析样品的原子或分子转化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速,常见离子化方法,EI(ElectronImpactIonization)：电子轰击电离硬电离CI(ChemicalIonization)：化学电离核心是质子转移FD(FieldDesorption)：场解吸目前基本被FAB取代FAB(FastAtomBombardment)：快原子轰击MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption)：基体辅助激光解吸，基质辅助激光解吸电离,电子轰击离子化(electronimpactionization,EI),主要用于挥发性样品的电离，由GC或直接进样杆进入的样品，以气体形式进入离子源，由灯丝F发出的电子与样品分子发生碰撞使样品分子电离。在70ev电子碰撞作用下，有机物分子可能被打掉一个电子形成分子离子，也可能会发生化学键的断裂形成碎片离子。,快原子轰击源（FastAtomicbombardment,FAB）,主要用于极性强、分子量大的样品分析。例如肽类、低聚糖、天然抗生素、有机金属络合物等。FAB源得到的质谱不仅有较强的准分子离子峰，而且有较丰富的结构信息。,激光解吸离子化(laserdesorptionionization,LDI)利用一定波长的脉冲式激光(短脉冲)照射样品使样品电离的一种电离方式。基质辅助激光解吸离子化（matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI）脉冲工作方式，适合于TOF，FTMS,属于软电离技术，适合于分析生物大分子，如肽、蛋白质、核酸等。得到的质谱主要是分子离子，准分子离子。碎片离子和多电荷离子较少。常用的基质有2，5二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、-氰基-4-羟基肉桂酸等表面增强激光解吸离子化（surfaceenhancedlaserdesorptionionization,SELDI）,常见离子化方法,大气压离子化（atmosphericpressureionization,API）ESI(ElectrosprayIonization):电喷雾电离属最软的电离方式气动辅助电喷雾离子化(pneumaticallyassistedelectrosprayionization)又称离子喷雾(ionspray)APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大气压化学电离同上，更适宜做小分子APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization)：大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子,电喷雾离子化(ElectronsprayIonization,ESI),在高静电梯度下，样品液发生静电喷雾，在干燥气流中形成带电雾滴，随着溶剂的蒸发，通过离子蒸发等机制，生成气态离子，进行质谱分析。主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴，最内层是液相色谱流出液，外层是雾化气，多为大流量的氮气，其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。另外，在喷嘴的前方还有一个补助气喷嘴，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。离子产生后，借助于喷嘴与锥孔之间的电压，穿过取样孔进入分析器。,ESI原理图,ESI的特点,ESI是一种软电离方式，即便是分子量大，稳定性差的化合物，也不会在电离过程中发生分解适合于分析极性强的大分子有机化合物，如蛋白质、肽、糖等，在电离的过程中容易形成多电荷离子。,ESI实验条件优化,待测物质在溶液中的状态（溶液化学）ESI过程是将离子从溶液中转移至气相，待测成分在供试品溶液中成为离子状态，可提高生成气相离子的效率，以提高检测灵敏度溶剂的表面张力如用纯水作溶剂，因其表面张力高，故形成Taylor锥和稳定喷雾所需电压高，可能导致放电，所以常用水/甲醇(50：50)溶剂，同时，水与甲醇混合，粘度也下降，有利于雾化。,ESI实验条件优化,溶液的流速与电导率电喷雾所得雾滴的半径与许多因素有关，如溶液的表面张力、介电常数、电导率、流速及加在毛细管尖端的电场等。改变流速是最方便的，低流速产生细雾滴，有利于产生气相离子，提高信号强度。在高流速范围，需采用高速同轴气流辅助雾化。雾滴的蒸发速率气相离子是从最终的非常细小的雾滴中产生的。如起始雾滴小，采用挥发性溶剂（甲醇、乙腈及其与水的混合物），溶液表面能较低，则溶剂迅速蒸发，易于产生更小的子雾滴，最终产生气相离子。为了提高溶剂蒸发速率，可提高“干燥气”的温度和流速，也可用加热金属毛细管使带电雾滴蒸发，但应注意高温可能造成热不稳定的待测成分分解及不挥发成分堵塞毛细管。水的热容量高，故溶剂中含水量高时，蒸发温度应予提高。,ESI实验条件优化,气相离子的产生表面活性高（具低溶剂化能）的离子将优先转移至雾滴表面，最终转变为气相离子，故有较高的实验灵敏度竞争机制：应采用表面活性低的缓冲剂；采用低浓度的挥发性的酸、碱及缓冲盐；用高纯度的溶剂、试剂；样品应作预处理，除去干扰物及盐。,大气压化学电离（AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI）,APCI是Horning等创导的，当时称为API并首次实现了与HPLC的连接。样品的离子化在处于大气压下的离子化室中完成。结构与ESI大致相同，不同之处在于APCI喷嘴的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。,APCI特点,APCI的优点是检测限低，易于与GC或LC连接。样品分子在EI中的绝对离子化效率是0.01%0.1%，而APCI的起始离子化效率几乎是100%。与CI相比较，APCI的离子-分子或电子-分子反应在大气压下进行，样品分子与试剂离子或电子可以进行有效碰撞，在短时间内经数次碰撞即可达到热平衡。,质量分析器,质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(m/z)分开,将相同的m/z离子聚焦在一起,组成质谱。,常用质量分析器,扇形磁场质谱仪(magneticsectormassspectrometer)四极质谱仪(quadrupolemassspectrometer,Q)三级串联四极质谱仪（triple-stagequadrupolemassspectrometer,TQMS）飞行时间质谱仪(time-of-flightmasssectrometer,TOFMS)傅立叶变换-离子回旋共振质谱仪(fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometer,FT-ICRMS)离子阱质谱仪（iontrapmassspectgrometer,ITMS),杂交质谱仪,杂交质谱仪是将不同类型的质谱仪串联起来，设计为性能更好的仪器。新型杂交质谱仪：四极-飞行时间质谱仪四极-线性离子阱质谱仪四极离子阱-飞行时间质谱仪线性离子阱-傅里叶变换质谱仪,检测器,电子倍增器（electronmultiplier）：扇形磁场质谱仪和四极仪器常用平面微通道板检测器（micro-channelplate,MCP）：飞行时间质谱仪常用,质谱仪性能指标,灵敏度有多种定义方法,粗略地说是表示所能检查出的最小量,一般可达到10-9-10-12克甚至更低,实际还应看信噪比。分辨率质谱仪把相邻两个质量分开的能力，如果某质谱仪在质量M处刚刚能分开M和M+M两个质量的离子，则该质谱仪的分辨率为R=M/M,质谱仪性能指标,质量范围质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。质量范围的大小取决于质量分析器。四极杆分析器的质量范围上限一般在1000左右，也有的可达3000，而飞行时间质量分析器可达几十万。由于质量分离的原理不同，不同的分析器有不同的质量范围。质量准确度质量测定的准确程度是高分辩质谱仪重要指标之一，对低分辩仪器则无任何意义。,质谱法分析的优点与局限性,优点测定分子量准确,其它技术无法比。灵敏度高,常规10-7-10-8g,单离子检测可达10-12g。快速,几分甚至几秒。便于混合物分析,LC/MS,MS/MS对于难分离的混合物特别有效,其它技术无法胜任。多功能,广泛适用于各类化合物。,质谱法分析的优点与局限性,局限性异构体,立体化学方面区分能力差。重复性稍差,要严格控制操作条件，所以不能象低场NMR,IR等自己动手,须专人操作.有离子源产生的记忆效应,污染等问题。价格稍显昂贵,操作有点复杂。,扇形磁场质谱仪,单聚焦扇形磁场质谱仪，双聚焦扇形磁场质谱仪。高分辨仪器，用于准确质量测定和高分辨选择离子监测。分辨率取决于狭缝宽，故提高分辨率将导致灵敏度下降。灵敏度也取决于离子的采样速率。在与色谱技术联用时，需要较高的采样速率，这也限制了扇形磁场质谱仪的应用。,四极质谱仪,二十世纪五十年代，WolfgangPaul和其同事在德国波恩大学发明了四极质量过滤器。,四极质谱仪性能,四极质谱仪与其它质谱仪相比较，仍然是应用得最为广泛的LC/API/MS仪器。单级四极质谱仪的主要优点是相对可靠、优良的性能价格比，适合于定性、定量分析。主要缺点是得到的是低分辨质谱，只有在测定的成分是纯的且没有化学背景杂质与之重叠时，才有可能测定准确质量。,四极质谱仪特点,Scan扫描模式用单级四极质谱仪作定量分析采用选择离子监测（selectedionmonitoring,SIM）。检测限取决于能否将目标化合物与样品中的其它成分包括背景干扰加以区别。虽然单级四极质谱仪没有MS/MS功能，但用源内CID（in-sourceCID）具有使离子诱导裂解的“准MS/MS”功能。,三级串联四极质谱仪,为空间串连质谱仪。具有MS/MS功能以进行化合物结构分析或用选择反应监测（selectedionmonitoring，SRM）以提高选择性及定量分析检测限。最简单，也是最常用的形式是第一级四极（MS-1）用于前体离子选择，RF-only四极作为CID区，最后一级四极分析产物离子（MS-2）。用LC/ESIMS进行复杂成分的定量分析时，如药物代谢动力学研究，TQMS仍然是首选的仪器。,CID技术,碰撞诱导分解(CollisionInduceddissociation,CID）又称碰撞活化分解(Collisionactivateddissociation,CAD)技术。碰撞活化分解在碰撞室内进行，带有一定能量的离子进入碰撞室后，与室内情性气体的分子或原子发生碰撞，离子发生碎裂。为了使离子碰撞碎裂，必须使离子具有一定动能，对于磁式质谱仪，离子加速电压可以超过1000V，而对于四极杆，离子阱等，加速电压不超过100V，前者称为高能CAD，后者称为低能CID。,三级串联四极质谱仪MS/MS功能,产物离子扫描（productionsscan）选择前体离子和测定由CID产生的所有产物离子。前体离子扫描（precursorionscan）选择某一产物离子和测定所有能经CID产生这一产物离子的前体离子。恒定中性丢失扫描（neutrallossscan）选定中性碎片，检测所有能丢失这一中性碎片的裂解反应。单、多反应监测（selectedreactionmonitoring,SRM;multiplereactionmonitoring,MRM）第一个质量分析器选定一个离子，这个离子应能经碰撞池产生第二个质量分析器选择的离子。,TQMS扫描模式示意图,飞行时间质谱仪,TOFMS仪器的基本结构主要由离子源和加速区，漂移区及检测器组成,离子在离子源中形成或自外部输入后为电场E所加速，进入漂移区，这是一个真空无场漂移区，经电场加速的离子通过这个区域到达平面检测器（常用微通道板，microchannelplate,MCP）产生信号。,飞行时间质谱仪,能量聚焦反射型TOF离子的延迟引出,飞行时间质谱仪性能,质量测定质量范围：理论上无质量上限,主要的限制是离子的检测器质量校正及准确度：双喷口技术，将样品与参比化合物交替或同时输入质谱仪，以随时对质量座标进行校正。数据采集和灵敏度TOFMS数据的采集有两种方式，即时间数字转换（TDC）或模数转换（ADC），TDC的优点是信噪比较好，而ADC的优点是动态范围较宽。检测高速飞行经漂移区到达检测器的所有离子，因而其全谱灵敏度和数据采集速度高于扫描仪器。,飞行时间质谱仪性能,与脉冲离子源连接，如激光解吸离子化LDI和MALDI,其脉冲工作方式的TOFMS是相匹配的。,飞行时间质谱仪性能,脉冲正交引出和连续离子源：将离子束输入从离子源中输入质量分析器时，经准直的低能离子束注入加速区（此时为无场区），然后，给予加速区一脉冲引出场，这一引出场严格垂直于连续离子束，这样，离子束被引出加速区，经漂移区到达与之平行的检测器，TOF的分辨率得到提高。,傅里叶变换离子回旋共振质谱仪FTICRMS,FTICRMS有很高的分辨率和很好的质量准确度。对蛋白质的多电荷分子和碎片离子能达到同位素分辨，因而易于确定离子的电荷数，使大的生物分子的MSn数据的解析成为可能。FTICRMS是ESI和MALDI良好的质量分析器。通常，ESI为外离子源，将ESI产生的离子用四极杆或静电透镜导入ICR分析池。FTICR需采用超导磁场及高真空，硬件、软件均较复杂等，使这种仪器费用较高，对操作者的要求也较高。,四级离子阱质谱仪,离子阱质谱仪的主体是一个环电极和上下两端盖电极组成，工作原理与四级质谱仪相同。,四级离子阱质谱仪性能,四极离子阱体积很小，费用较低，使之广泛用于LC/MS，尤其是蛋白质组学研究。影响检测限的主要因素是离子导入和捕获的效率，以及操作有效周期。离子在注入和捕获过程中会损失。离子阱质谱仪是低至中分辨率仪器。慢扫描“zoomscans”可提高分辨率，确定多电荷离子的电荷数。由于空间电荷效应和其它电场的影响，质量座标偏移，故难以进行准确质量测定。,四极离子阱质谱仪性能,在离子阱中，采用CID，选择前体离子並使之在碰撞气中加速和减速而完成的。缓慢和缓和的低能碰撞效率较高，但离子发生重排的倾向优先于单键裂解。产物离子光谱通常由几个丰度较高的离子所组成，缺少低质量端的信息。所必，为了进行结构分析MSn的实验常常是必须的。定量分析不是离子阱质谱仪的强项，这是因为这种仪器的动力学范围有限，加之在捕获期间，离子-分子、离子-离子相互作用的发生，进一步对定量造成不利影响。,FTICRMS和ITMS所进行的多级质谱实验常称之为“时间串联”，与四极质谱仪和扇形磁场质谱仪的“空间串联”不同。在FTICRMS和ITMS，MS/MS实验是通过对捕获的离子进行一系列操纵实现的。这些操纵包括离子的排斥（用于选择前体离子），离子的激发（增加动能以实现CID）和离子的检测。这两种仪器均不能进行母离子扫描和中性丢失扫描。,LC-MS联用技术的发展,1969年,首次出现液相色谱质谱联用技术1977年,LC-MS开始投放市场1978年,LC-MS首次用于生物样品中药物分析1989年,LC-MS/MS取得成功1991年,APILC-MS开始应用于药物开发1997年,LC-MS开始应用于药物动力学1999年,LC-APIQ/TOF投放市场,接口技术需要解决的问题,如何使液相色谱的高流速与一般质谱的气相和高真空条件相配套如何将不挥发和热不稳定的化合物软电离从而得到质谱信息如何将被分析物的离子有效地传送入质谱仪，尤其是分析痕量化合物,LC-MS接口技术的发展,传送带接口（Moving-BeltInterface,MBI）离子束接口（ParticleBeamInterface,PBI）直接液体导入（DirectLiquidIntroduction,DLI）大气压电离（AtmosphericPressureIonization,API）ESI,APCI,APPI(atmosphericpressurephotoionization)音喷离子化(SonicSprayIonization，SSI)连续流快原子轰击(Continuous-FlowFast-AtomBombardment，CF-FAB)离子蒸发（LiquidIonEvaporationLIT）热喷雾（Thermospray,TSP）,Moving-beltinterface1977Direct-liquid-introductioninterface1980Thermosprayinterface1983FritFAB/continuous-flowFABinterface1985/1986Atmospheric-pressurechemicalionizationinterface1986Particle-beaminterface1988Electrosprayinterface1988Atmospheric-pressurephotoionizationinteface2000,大气压电离（API）技术,目前大气压电离特指：电喷雾（ESI），离子喷雾（IS）和大气压化学电离（APCI）。灵敏度达fg-pg适用于极性和离子型化合物进样方式多样灵活直接流动进样与液相色谱联用与毛细管电