hu仪器分析第3章分子发光分析法

,仪器分析,第三章分子发光分析法,molecularluminescenceanalysis,3.1分子荧光和磷光Molecularfluorescenceandphosphorescence3.2分子荧光和磷光分析法Molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis3.3分子发光分析Chemiluminescenceanalysis,第三章分子发光分析法,一、分子荧光与磷光产生过程luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence二、激发光谱与荧光光谱excitationspectrumandfluore-scencespectrum三、荧光的产生与分子结构关系Relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure四、影响荧光强度的因素Factorinfluencedfluorescence,第一节分子荧光与磷光,molecularluminescenceanalysis,molecularfluorescenceandphosphorescence,3.1.1荧光与磷光的产生过程,由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、电子激发单重态S1、S2；第一、第二、电子激发三重态T1、T2；,3.1分子荧光和磷光,2.电子激发态的多重度,电子激发态的多重度：M=2S+1S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；,S0T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；,分子吸收辐射后,电子被激发且不发生自旋方向的改变ms为+1/2和-1/2,s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为激发单重态,用符号S表示。（S1S2S3）,电子被激发且伴随着自旋方向的改变ms为+1/2和+1/2,s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为激发三重态,用符号T表示。（T1T2T3）,3.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-710-9s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态；,辐射能量传递（发射光子）非辐射能量传递化学反应,去活化（激发态基态）三种形式：,荧光,磷光,振动弛豫,内转换,系间跨越,外转换,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。,辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为S1S0跃迁），发射波长为2的荧光；10-710-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；221；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0T1禁阻跃迁）S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1发光速度很慢：10-4100s。光照停止后，可持续一段时间。,（1）荧光的激发光谱,激发光谱：表示不同激发波长下所引起物质发射某一波长荧光的相对效率。,绘制激发光谱：固定发射波长(选最大发射波长),然后以不同波长的入射光激发荧光物质，以荧光强度F对激发波长作图，即为激发光谱。,荧光分子都具有两个特征光谱：激发光谱和发射光谱（荧光光谱）。,3.1.2激发光谱与荧光(磷光)光谱excitationspectrumandfluore-scencespectrum,激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大，称为最大激发波长ex,（2）荧光的发射光谱（荧光光谱）,荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光波长固定在ex处，然后对发射光谱扫描，测定各种波长下相应的荧光强度，以荧光强度F对发射波长作图，得发射光谱图（即荧光光谱）。,发射光谱（荧光光谱）的位置？磷光光谱的位置？,3.激发光谱与发射光谱的关系,a.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如2)。c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。,镜像规则的解释,基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；,基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。,3.1.3荧光的产生与分子结构的关系relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure,1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（）：,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；,与激发态分子失活过程的速率常数有关,发射过程中的速率常数,其他过程有关的速率常数，主要取决于环境,（1）、长*共轭结构：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生。大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环具有共轭的*跃迁。其共轭程度愈大，荧光效率也愈大，波长长移。,2.化合物的结构与荧光,刚性结构可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。分子的刚性和共平面性越大，越大，荧光强度越强。,1,=0.18,=0.92,(非荧光物质),（2）分子的刚性,有些物质本身不发荧光或荧光较弱，但和金属离子形成配合物后，如果刚性和共平面性增加，就可以发荧光或增强荧光。如8-羟基喹啉是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+等金属离子形成的配合物的荧光增强，利用这一特点可以间接测定金属离子。,（3）取代基团对分子荧光的影响给电子取代基：能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高。如NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等；吸电子取代基：可减弱分子电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等还有一类取代基则对荧光的影响不明显，如R、SO3H、NH3等。,影响荧光强度的外部因素1、温度当温度升高时，介质粘度减小，分子运动加快，分子间碰撞几率增加，从而使分子无辐射跃迁增加，荧光效率降低。,3.1.4影响荧光强度的因素relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure,2、溶剂（1）荧光强度在一定范围内可随溶剂黏度的减小而减小；（2）溶剂和荧光物质形成化合物，改变物质的性质；（3）荧光波长随溶剂极性增大而长移。(4)溶剂与分子轨道发生作用，改变跃迁能量特殊作用;(5)氢键、改变荧光物质解离状态,增溶、增敏、增稳作用。优点：（1）增加荧光物质的溶解度；（2）增加摩尔吸光系数；（3）增加荧光物质的稳定性。例如：环糊精，十二烷基磺酸钠,3.表面活性剂,4.pH值,（1）溶液pH值改变，物质分子和其离子间的平衡也随之发生变化，而不同形体具有其各自特定的荧光光谱和荧光效率。例如苯胺：,（2）溶液pH值的改变会影响配合物的组成，从而影响它们的荧光性质。Ga3+邻-二羟基偶氮苯pH341:1配合物（荧光）Ga3+邻-二羟基偶氮苯pH6712的配合物（无荧光）。,5.内滤光作用和自吸现象,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。,内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；,6.溶液荧光的猝灭,荧光熄灭是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenchingmedium)。如卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均为常见的荧光熄灭剂。,碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。,7.散射光,小部分光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射。,瑞利光：光子和物质发生弹性碰撞，不发生能量交换，只是光子运动方向发生改变。其波长与入射光波长相同。,拉曼光：光子和物质发生弹性碰撞，发生能量交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量。从而发射出比入射光稍长或稍短的光。,散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光，与荧光波长接近，对测定的干扰大，必须采取措施消除。拉曼光的干扰主要来自溶剂，当溶剂的拉曼光与被测物质的荧光光谱相重叠时，应更换溶剂或改变激发光波长,选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰,a:320nm或350nm为激发光，荧光峰总是在448nm。b:将空白溶剂分别在320nm及350nm激发光照射下测定荧光，激发光波长为320nm时，拉曼光波长是360nm，360nm的拉曼光对荧光无影响；当激发光波长为350nm时，拉曼光波长是400nm，400nm的拉曼光对荧光有干扰，因而影响测定结果。,硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光与散射光谱,3.1.5常用荧光试剂fluorescentreagent,荧光试剂是一种可以使非荧光物质或弱荧光物质与其反应之后，得到强荧光性产物的标记物，从而可扩大荧光分析法的使用范围,1.有机化合物的荧光分析,脂肪族化合物能产生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因存在共轭体系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能发射荧光。有时为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物(衍生化)。因此，荧光分析法在有机物测定方面的应用很广。,能用荧光分析法测定的有机物包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等；药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等；甾体类如皮质激素及雌醇等；抗生素类如青霉素、四环素等；维生素类如维生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗坏血酸、叶酸及烟酰胺等。此外，中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类，都能产生荧光，可用荧光分析法作初步鉴别及含量测定。荧光分析法的灵敏度高，选择性较好，取样量少，方法快速，已成为医药学、生物学、农业和工业等领域进行科学研究工作的重要手段之一。以下是几个重要的荧光试剂：,1荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族或芳香族伯胺类形成高度荧光衍生物，典型反应如下：,荧光胺及其水解产物不显荧光。100mg荧光胺溶于100ml无水丙酮中，放置24小时后即可使用。取相当于10mg药物的甲醇或水溶液0.lml，加适宜pH值的磷酸缓冲溶液5ml，加荧光胺试剂0.lml，混合，放置15分钟后测定荧光强度。荧光条件为：ex=275、390nm，em=480nm。,2邻苯二甲醛(OPA)在2巯基乙醇存在下，pH910的缓冲溶液中OPA能与伯胺类、特别是除半胱氨酸、脯氨酸及羟脯氨酸外的a氨基酸生成灵敏的荧光产物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，加200ml2巯基乙醇，将此混合液加至1L3的硼酸溶液中，再用KOH调节至pH10，即为常用试剂溶液。荧光条件为：ex=340nm，em=455nm。,31二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯)能与伯胺、仲胺及酚基的生物碱类反应生成荧光性产物。取50mg或100mg试剂，溶解于500ml无水丙酮中即可使用。与丹酰氯类似的一个试剂是丹酰肼(DansylNHNH2)，它能与可的松的羰基缩合，产生强烈荧光。荧光条件为：ex=365nm，em=500nm左右。丹酰氯试剂不稳定，其水解产物DansylOH呈蓝色荧光，必须暗处保存，每周重新配制。,无机离子一般不显荧光，与有机试剂形成有荧光的配合物后，可测量约60种元素及离子铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土采用荧光分析法氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定铜、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,2.无机化合物的分析,第三章分子发光分析法,3.2.1仪器与结构流程instrumentandgeneralprocess3.2.2荧光分析法和应用fluorescenceanalysisandapplication3.2.3磷光分析法的应用phosphorescenceanalysisandapplication,第二节分子荧光与磷光分析法,molecularluminescenceanalysis,molecularfluorescenceandphosphorescenceanalysis,3.2.1仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。,1.荧光光谱仪的基本结构,荧光光谱仪与紫外-可见分光光度计光路设计有什么区别？,2.荧光光谱仪的主要部件,为荧光测定提供足够强度的、稳定的激发光氙灯、高压汞灯,将光源发出的复合光分解为单色光光栅、滤光片,盛放试样石英、四面透光,将荧光物质产生的荧光分解为单色光光栅、滤光片,将荧光信号转换为电学信号灵敏光电倍增管,同步扫描技术,根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可变波长三种；,同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。合适的可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。,可获得三维光谱图的仪器,可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图,磷光检测,荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。,测量方法：（1）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。（2）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要杜瓦瓶。,3.2.2荧光分析方法与应用,1.特点（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高24个数量级；为什么？检测下限：0.10.1g/cm-3相对灵敏度：0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少缺点：应用范围小。,因为荧光或磷光分析法是在入射光的直角方向测定荧光强度，即在黑背景下进行检测，因此可以通过入射光强度I或者增大荧光或者磷光信号的放大倍数来提高灵敏度，而紫外-可见法中测定的参数是吸光度，该值与入射光强度和透射光强度的比值相关，入射强度增大，透射光强度也随之增大，增大检测器的放大倍数也同时影响入射光和透射光的检测，因而限制了灵敏度的提高,2.定量依据与方法,(1)定量依据荧光强度If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率：If=Ia由朗-比耳定律：Ia=I0(1-10-lc)If=I0(1-10-lc)=I0(1-e-2.3lc)浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3I0lc=Kc,（2）定量方法,标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；标准对比法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；,3.荧光分析法的应用,(1)无机化合物的分析与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析见表,