流式细胞仪原理及应用ppt课件

致：,流式细胞术概述,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位,流式细胞仪的原理,液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。,光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号,电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者,散射光信号,散射光信号,RightAngleLightDetectorCellComplexitySSC,ForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSC,IncidentLightSource,前向角散射光（FSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪的检测信号,荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,数据存储,FCS2.0格式常以列表模式（LISTMODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE双染样本,数据显示,直方图（Histogram）二维点图（DotPlot）等高线图（ContourPlot）密度图（Density）三维图（3DPlot）等,单参数直方图分析,数据分析,直方图分析,多参数散点图分析,数据分析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,流式细胞仪的应用,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数淋巴细胞亚群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的免疫状态监测干细胞计数阵发性血红蛋白尿HLA-B27检查血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研应用,免疫功能研究血小板分析（心脑血管疾病）细胞周期和倍体分析细胞凋亡干细胞研究树突细胞研究肿瘤相关基因表达的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究放疗/化疗疗效的研究,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B）Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/Ts：机体免疫功能低下：AIDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排；Th/Ts持续表明可能感染，比值成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,CD45的临床应用,用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群体，当幼稚细胞达70-80%时，即可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞B淋巴细胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞：CD45+、CD（16+56）+/CD3-单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,正常人骨髓细胞免疫表型,淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞）单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA-粒系细胞:原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异巨核细胞：CD45+、CD41+/CD61+幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+,T-ALL免疫表型,B-ALL免疫表型,HL,A,-,DR,CD19,CD10,CD20,CD22,CD79,a,其它,早期前,B,-,ALL,+,+,-,-,C,+,/M,-,+,34/38,+,普通型ALL,+,+,+,-,C,-,/M,+,34/38,前,B,-,ALL,+,+,+,+,B,-,ALL,+,+,-,+,+,+,Kappa,+,/,Lambda,+,*,CD10,+,的,ALL,疗效好，有,CD34,+,病人往往合并,t(9,22),需强化治疗,成熟,AML免疫表型,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,FCM在临床血液学中的应用,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7诊断双系或双表型白血病发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病诊断少见疑难白血病（如HCL）,免疫分型对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。混合性白血病。部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。慢性淋巴细胞白血病。微小残留白血病。,阵发性血红蛋白尿PNH,阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血患者体内红细胞呈不均一性利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例,阵发性血红蛋白尿PNH,正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完全阳性PNH患者血细胞分为三型：型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间型：CD59表达完全阴性分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度,红细胞PNH分析,A正常人BD病人,网织红细胞计数Retic-COUNT,操作快速、简便计数精确低水平网织红细胞检测网织红细胞成熟指数IRF,临床应用：预测骨髓移植效果判断贫血发病原因评价生物制剂的疗效,网织血小板的检测,人们最先于1969年指出网织血小板是一类能被新亚甲蓝深染的血小板。如网织红细胞一样它们是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人们发现网织血小板为骨髓新释放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中网织血小板的多少，可以间接反映骨髓巨核系造血的活跃程度。并能用常规的检测网织红细胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式细胞仪上方便、准确地检测。,临床应用,正常人网织红细胞1.07%缺铁性贫血（IDA)4.78%,临床应用,再障（AA)0.03%溶血性贫血（HA)29.33%,造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。造血干细胞的特征是：大小（FSC）和颗粒度（SSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似细胞内含有较多核酸物质CD34表达弱阳性或强阳性CD45表达弱阳性在干细胞移植时需要做造血干细胞绝对计数,造血干细胞计数,干细胞移植应用,血液系统病症:L&L,再生障碍想贫血恶性肿瘤:乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌遗传性异常病变免疫缺陷:血红蛋白病,血小板检测,血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病CD41-CD61复合物：血小板无力症CD42a-CD42b复合物：巨大血小板症血小板活化的相关检查血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1血小板减少性疾病血小板自身抗体检测网织血小板的检测血小板脱落微粒的检测,血小板活化,IIb/IIIa复合物（CD41/CD61）在所有静止和活化的血小板上都有表达血小板活化时发生的改变IIb/IIIa复合物发生变构，表达PAC-1血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达CD62P,CD61圈血小板门PAC-1/1：阴性对照，静止的血小板PAC-1/CD62P：试验管，ADP刺激下活化的血小板，报告血小板活化百分含量,血小板活化,血小板活化,直接测量循环血小板活化状态与反应性可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性缺血性脑血管病与血小板活化有关子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加抗血小板治疗疗效监测,脑栓塞病人血小板活化检测,ACD61-SSC设分析门B阴性对照C治疗前PAC-I27.74%CD62P15.86%D溶栓后PAC-I9.13%CD62P4.12%,血小板无力症（CD41缺陷，PAC-I下调）,巨血小板症,蓝阴性对照绿正常人红病人CD41表达上调CD42a/CD42b缺失,血小板自身抗体ITP病人,DNA细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,DNA细胞周期分析参数,DNA倍体性Ploidy细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数（DI）测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性S期含量SPFS期细胞占总周期细胞的比例增殖指数PI增殖细胞占总周期细胞的比例CVG0/G1期细胞DNA含量变异系数,DNA分析的临床意义,DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰S期细胞含量10-15%DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，提高治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液、灌洗液脱落细胞的分析，意义尤为重要。研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系。提示肿瘤患者预后。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。,FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在淋巴瘤（L&L）病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,FCM参数的预后意义,DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤S期比率与肿瘤组织学分级密切相关：肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤,细胞凋亡PI分析,PI-Fluorescence,#Events,凋亡细胞,正常G0/G1期细胞,128,正常DNA倍体分析,129,Aneuploidpeak,DNA异倍体,秋水仙素处理罗田甜柿获得12倍体再生植株,正常人骨髓细胞DNA周期分析（ModFIT）,132,肿瘤细胞SPF(S期含量),肿瘤细胞(单克隆)(14.18%),正常骨髓细胞(2.93%),肿瘤细胞(多克隆)(28.52%),乳腺癌及乳腺良性病变的流式检测对比分析,细胞凋亡,细胞凋亡的分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程细胞凋亡的主要检查手段形态学检查DNALadders实验流式细胞仪检查与凋亡相关的病理过程（HIV、自身免疫性疾病、肿瘤）研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对凋亡的影响,凋亡检测-每一步都有检测试剂盒,细胞凋亡检测,凋亡相关细胞膜变化的检测凋亡相关线粒体变化的检测凋亡相关酶活性的检测凋亡相关DNA片段的检测凋亡相关基因蛋白的检测,细胞膜变化的检测早期凋亡,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，DNA不断裂线粒体膜电位变化的检测细胞内氧化还原状态改变的检测,细胞膜变化的检测,磷脂酰丝氨酸（PS）的检测早期凋亡,早期凋亡PS检测及结果判断,早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性DNA没有发生断裂结果判定早期凋亡：AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡：AnnexinV+/PI+正常的活细胞：AnnexinV-/PI-,ANNEXIN-V/PI检测,142,ANNEXIN-V/PI检测,control,处理16h后,处理24h后,线粒体水平检测相关产品,线粒体膜电位的检测BDMitoscreen（JC-1）Cat#55130225tests原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合而产生绿色荧光。操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测,JC-1检测结果流式图,凋亡相关酶活性的检测,背景知识细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解Caspase3激活=细胞凋亡检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性。,CBA分析凋亡信号通路,DETECTORANTIBODY,LYSATEORSUPERNATANT,BEADS,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Wash,ReadonFlowCytometer,ActiveCaspase-3,Bcl-2,CleavedPARP,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本和检测抗体孵育后，形成“三明治”复合物,ActiveCaspase-3,Bcl-2,CleavedPARP,Bcl-2、Caspase-3、PARP构成的凋亡调控通道主要蛋白，对于凋亡研究具有特殊的意义(CBAHumanapoptosiskit557816),流式检测活性Caspase-3,相关产品：ActiveCaspase-3Apoptosiskit（550914），包含了固定破膜液，洗涤液和PE标记抗体；特点：细胞需要固定破膜，然后才能染色,149,化疗前后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞,化疗前(3.49%),化疗后(94.86%),DNA水平的凋亡检测-晚期检测,凋亡晚期DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段检测方法Tunel流式法，通过在核酸片段末端标记，跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比DNALadder分析，但凋亡细胞太少时作不到,TUNEL简介,通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP（多为dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通过荧光检测定量分析结果。,TUNEL（Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnick-end-labeling）,152,DNA断裂点检测,TUNEL法流式分析凋亡结果,154,BrdU-FITC/PI检测,S期,凋亡检测总结,检测水平细胞核酸细胞膜胞内通路线粒体,微生物,微生物,细菌的计数检测与鉴定（CBA)血清血诊断(CBA)抗生素敏感性实验,细胞活力检测（细菌活力）,图流式细胞术分析GFP转染效率和表达量,调节性T细胞研究进展,免疫耐受机制,以往研究认为：（“被动”方式）胸腺细胞及前B（pre-B）细胞在中枢免疫器官中的克隆清除进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视,免疫耐受机制,近年研究表明：（“主动”方式）调节性T（Tr）细胞以“主动”的方式维持自身免疫耐受,这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响。,调节性T细胞的特异性标志,FOXP3（ForkheadboxproteinP3）是一个50kD的转录因子，也称为Scurfin、JM2、IPEX。它是一个主要调节基因。CD4+/CD25-细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR、CD103和CTLA4的表达，并且促使调节性T细胞表型形成。FOXP3在X连锁自身免疫过敏失调综合征（XLAAD或IPEX）患者中发生突变。FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降，表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子。FOXP3表达于细胞内,调节性T细胞分类,根据来源、特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞天然性调节性T细胞：在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有510的细胞持续高表达CD25分子，该群细胞从胸腺中发育，组成性表达foxp3，在体内外发挥免疫调节功能获得性调节性T细胞：是由外周T细胞在特定的条件下分化出来，通过分泌高水平的IL-10和TGF-而发挥其抑制功能.,RegulatoryTCellsBackground:itsDevelopment,Thymus,Periphery,Tcellprecursor,Tr1,Th3,FoxP3-,?,iDCand/orinthePresenceofIL-10And/orTGFb,ConventionalTcell,NaveTcell,NaturallyoccurringTregcell,AdaptiveTregcell,CD25,GITR,FoxP3+,CD4,CD127,CD25,GITR,FoxP3+,CD4,CD127,FoxP3-,人Tr细胞表达特征：CD127+,CD127是非二聚体IL-7受体CD127表达于胸腺细胞，T、B祖细胞，成熟T细胞，单核细胞及其它淋巴细胞和骨髓细胞T细胞活化后CD127表达下调CD127表达下调发生在Tr细胞CD127下调同时CD25高表达、FoxP3+为Tr细胞CD127优于传统的FoxP3+保证了细胞的活性,从HumanPBMCs中分离Tr细胞,FoxP3染色确认Tr细胞,FoxP3染色确认Tr细胞,小结,CD127弱表达FoxP3+CD127loCD25hi-intCD127和FoxP3联合应用于Tr细胞的功能性研究（体内体外）,树突状细胞（dendriticcell，DC）,DC的生物学特点,DC因其具有膜样或树突样突起而得名DC包括郎罕氏细胞、间隙DC、滤泡DC（FDC）、并指DC（IDC）等等。其在体内含量甚微，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的1以下，但分布非常广泛，在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中都有存在。,DC的生物学功能,D