大肠杆菌基因表达系统.ppt

第八章大肠杆菌基因表达系统,克隆基因的表达：,外源基因在宿主细胞中表达。,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞。,一、原核表达系统的注意事项,外源基因不能带有内含子。,2.必须用cDNA或者是化学合成的基因。,3.不能直接用真核基因组DNA。,4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）,5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。,除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件：1.强启动子、强转录终止子2.可诱导性3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等,二、理想原核表达载体具备的基本特征,AdividingE.coli,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,必须是一种强启动子,应呈现低水平的基础转录,应是可诱导型的,用温度或化学试剂诱导。,（1）最佳启动子必须具备的条件,基因工程常用的原核启动子,乳糖启动子lac,色氨酸启动子trp,cI857:,噬菌体启动子是PL,42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录,28oC时阻遏PL，外源基因不转录。,三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位,1.细胞质中表达,（1）包涵体（inclusionbody）,是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。,形成原理未知。,使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞,回收的蛋白生物活性差。,缺点,优点,2.周质中表达,（1）周质（periplasm）,格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。,phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-内酰胺酶（lactamase）,（3）常用的原核信号肽,大肠杆菌的信号肽：,能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。,（2）信号肽（signalpeptide）,一般位于N端。,金黄色葡萄球菌的蛋白A。,鼠源RNase、人生长激素信号肽。,也能在细菌中起作用。,（2）真核信号肽,用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；,使表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。,3.胞外表达,或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点：,四、几种类型的原核表达载体,1.非融合型表达载体,缺点：,产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。,容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。,pKK223-3载体,组成结构：,条件：,必须选择一个有lacI的宿主菌。,tacP,LacO,S-D,插入位点区,rrnBT,宿主lacI,表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,阻遏物,IPTG,载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pINIII系列：,2.分泌型表达载体,pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,Ompa：大肠杆菌外膜蛋白基因,组成结构,Ipp：脂蛋白基因启动子,pINIII-comA1,以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.,表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。,3.融合蛋白表达载体系统-pGEX系列,（1）优点,便于融合蛋白的分离和纯化。,lacI,tac,lacO,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。,（3）产物提纯,（2）组成结构,（4）产物分离,用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,柱（column）,GST,外源蛋白,凝血酶,外源蛋白,柱（column）,GST,GST,洗脱,柱（column）,可再利用,pGEX,插入区：,pGEX-1T,CTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATCGTGACTGACTGACGA,LeuValProArgGlySerProGluPheIleValThrAsp,EcoRI,BamHI,凝血酶,CTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACG,LeuValProArgGlySerProGlyIleHisArgAsp,EcoRI,BamHI,凝血酶,ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGAC,IleGiuGlyArgGlyIleProGlyAsnSerSer,EcoRI,BamHI,Xa因子,pGEX-2X的插入区：,pGEX-3X的插入区：,SmaI,SmaI,（5）其他融合蛋白系统,His-tag（组氨酸标签）：,在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。,His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,（2）-35区与-10区之间的距离,（1）-35区和-10区的碱基顺序,五、影响外源基因表达效率的因素,1.启动子的结构对表达效率的影响,5-AGGAGGU-3,S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。,2.翻译起始序列对表达效率的影响,（1）S-D序列,？,AUG左侧的三个碱基也有影响。,（2）起始密码AUG,-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。,3.启动子与外源基因之间的距离,3.启动子与外源基因之间的距离,4.转录终止区对表达效率的影响,5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响,6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响,选择强启动子序列，如tac等,六、提高表达水平常用的方法,2.调整S-D序列与AUG间的距离,3.改变起始密码下面的几组密码子,一般为5-9bp。,能提高翻译的起始效率。,4.增加mRNA的拷贝数和稳定性,“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻击。,5.减轻宿主细胞的代谢负荷,合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。,将宿主生长代谢与外源基因表达分开。,（1）诱导表达,一般采用温度诱导或药物诱导。,cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。,32C:,42C:,cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。,cI857,PL,外源基因,PO,PL启动子是温度诱导型,调节基因lacI（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。,无IPTG:,阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。,有IPTG:,阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,tac启动子是药物诱导型,（2）表达载体诱导复制,将宿主的生长与载体的复制分开。,当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。,（1）设计成融合蛋白,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,6.提高表达产物的稳定性,防止被宿主的酶降解。,使用lon-菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,（2）使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解,减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。,（3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外