基因工程的基本工具和操作程序.ppt

高中生物复习课件,卉原中学王廷杰,选修三现代生物科技专题,致同学们,专题一基因工程,专题二细胞工程,专题三胚胎工程,专题四生物技术的安全性和伦理问题,专题五生态工程,异想天开,第一讲基因工程的基本工具和操作程序,【考纲解读】,一、基因工程的诞生：,基因工程又叫做DNA重组技术。是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组技术和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切拼接导入表达,DNA重组技术,生产人类需要生物类型和生物产品,基因重组（定向）,我国科学家培育出的转基因抗虫棉,科技探索之路,基础理论和技术的发展催生了基因工程,1、基础理论突破：DNA是遗传物质的证据DNA双螺旋结构模型的提出中心法则的确立遗传密码的破译2、技术发明支持：基因转移载体的发现工具酶的发现DNA合成和测序技术的发明DNA体外重组的实现重组DNA表达实验的成功第一例转基因动物的问世PCR技术的发明,二、DNA重组技术的基本工具,工欲善其事，必先利其器,分子手术刀：限制性核酸内切酶分子缝合针：DNA连接酶分子运输车：载体,1、限制性核酸内切酶,分子手术刀,限制性核酸内切酶简称限制酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。如：EcoR、Sma等。限制酶能够识别双链DNA分子的某些特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，如：EcoR、Sma等。也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有粘性末端和平末端两种形式。,限制酶的识别序列：,大肠杆菌中的一种限制酶（ECOR）能够专一识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。,平末端,平末端,限制酶的功能,黏性末端,黏性末端,ECOR,Sma,Sma能够识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,寻根问底:,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,要获得某个目的基因须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,把两者的黏性末端通过碱基配对黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?,限制性内切酶切割的部位是哪里？,要切两个切口,会产生相同的黏性末端,实际还不够，还需要DNA连接酶进行连接。,脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键,思考,产生四个黏性末端,两个,DNA连接酶,2、DNA连接酶,分子缝合针,连接DNA两条链骨架上的缺口，形成磷酸二酯键。,DNA的结构,氢键,磷酸二酯键,DNA连接酶,DNA聚合酶,DNA（水解）酶,解旋酶,限制酶,寻根问底,比较DNA连接酶与DNA聚合酶,只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,3、基因进入受体细胞的载体,分子运输车,（1）载体的作用：,将外源基因送入受体细胞,（2）载体的种类：,质粒,噬菌体的衍生物,动、植物病毒,（3）质粒：,是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA以外的，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。,大肠杆菌质粒的特点：,质粒,有复制原点，能携带着插入的目的基因一起复制，使目的基因扩增。,有切割位点，可供外源基因插入。,有标记基因，可用于鉴定和选择。,载体应具备的条件：,1、有切割位点供外源DNA片段(基因)插入。限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外。2、能自我复制提供大量的目的基因。3、有标记基因供重组DNA的鉴定和选择。4、载体DNA必需是安全的不能被受体细胞清除，不能伤害受体细胞，也不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5、载体DNA分子大小应适合以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,基因工程的基本工具,分子手术刀：限制性核酸内切酶分子缝合针：DNA连接酶分子运输车：载体,三、基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因操作“四步曲”,1、目的基因的获取,（1）概念：目的基因是人们所需要转移或改造的基因，主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,（2）获取方法：,从基因文库中获取利用PCR技术扩增人工合成,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,自然界,人工,从基因文库获取目的基因,基因文库,基因组文库,部分基因文库,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,如：cDNA文库,基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当的限制酶切割,许多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,推测,通过DNA合成仪人工直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸序列,mRAN的核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,推测,合成,基因文库,包括,限制酶切割,反转录,利用PCR技术扩增目的基因,PCR（多聚酶链式反应）技术,（1）概念：PCR是多聚酶链式反应（polymerasechainreaction）的缩写,它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。,高温变性（9095）,低温退火（5560）,中温延伸（7075）,多次重复,（2）过程：,以指数形式（2n）扩增。,（3）特点：,PCR技术的过程,DNA变性：（90-95）：双链DNA受热后，氢键断裂，形成单链DNA。,退火：（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA单链相应互补序列结合，形成局部双链。,延伸：（70-75）：在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。,如此循环往复，使基因成指数形式扩增。,原核细胞基因的结构,编码区,非编码区,基因,能转录，编码蛋白质,不编码蛋白质,但能调控遗传信息的表达,真核细胞基因的结构,启动子,编码区上游的非编码区,编码区,编码区下游的非编码区,终止子,编码区,非编码区,基因,外显子,内含子,真核,原核,编码区中能编码蛋白质的序列,不编码区中编码蛋白质的序列,2、基因表达载体的构建,基因工程的核心,（1）构建过程：,（2）基因表达载体的组成：,插入基因,启动子,终止子,标记基因,复制原点,目的基因启动子终止子复制原点标记基因,3、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,植物细胞动物细胞微生物细胞（大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等）,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,转化方法：,方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,思考：为什么常选用微生物作为受体细胞？,农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,基因枪法,花粉管通道法,导入动物细胞,显微注射仪,导入微生物细胞,Ca2+处理,易被吸收,感受态细胞,原核生物：,作为受体细胞。繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少。,质粒,不易被吸收,将目的基因导入受体的方法,39,DNA,4、目的基因的检测和鉴定,目的基因（DNA）,复制,RNA,转录,蛋白质,翻译,性状,检查是否成功,个体水平鉴定,检测染色体的DNA上是否插入了目的基因,个体水平鉴定性状鉴定分子水平检测分子杂交,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译出了蛋白质,分子杂交DNADNA（探针）,抗虫、抗药、抗病等接种试验,分子杂交DNARNA（探针）,分子杂交抗原抗体,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,P15思考与探究,原核细胞的基因结构及表达,与RNA聚合酶结合位点,mRNA,全力投入会使你与众不同，你是最优秀的，你一定能做的更好！,请拿出你的课本（1-16页），双色笔和学案，还有你的,你准备好了吗？,激情,1、简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。2、认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。3、简述基因工程原理及基本操作程序。4、尝试设计某一转基因生物的研制过程。,【重点和难点】,1、三种基本工具及其作用。2、基因工程载体需要具备的条件。3、基因工程基本操作程序的四个步骤。4、从基因文库中获取目的基因，PCR技术。,【学习目标】,第一讲基因工程的基本工具和操作程序,一、自主纠错、疯狂记忆（约3分钟）,对照参考答案纠正导学案的错误并理解记忆。,要求：静心、动脑，深入思考。让自己知道哪些懂了，哪些还不懂，不懂的要用红笔画出来，以便讨论时重点突破。,温馨提示,疯狂记忆1、基因工程的概念。2、基因工程的基本工具。3、基因操作的基本程序。,全力投入会使你与众不同,你是最优秀的。你一定能做的更好！,二、小组合作、讨论解疑（约10分钟）,要求：1、组长负责协调好分层讨论，先一对一讨论（3-5分钟），然后组内讨论，纠正好答案。要求每个人都有事干，注重讨论的效率。2、要讨论出自己的东西，讨论完的同学整理总结知识，注意总结本组好的解题方法和规律，准备展示。,讨论内容：1、自学中不能独立解决的问题。2、一会儿要展示的问题：（1）【自主预习】（2）【合作探究】（3）【课堂检测】,比一比，看一看，哪个小组效率高？,三、踊跃展示、高效点评、大胆质疑：,展示要求：1、口头展示：面向同学、语言简洁、准确，声音洪亮；书面展示：规范快速，注重总结规律方法。2、讨论完毕总结整理完善，力争全部过关。非展示同学：在同学展示的时候继续讨论或记忆总结。并学会倾听，学会整理自己的答案，准备点评补充和质疑。,点评要求：1、点评时声音洪亮脱稿，注重自己的“教态”。2、点评讲究方法：先评书写、再评对错、后总结方法规律。3、点评讲究效率：言简意赅，遇不明白时及时让给其他同学。非点评同学：注意倾听、思考，关键内容做好笔记，有补充或不明白的地方及时、大胆提出。,踊跃展示（5分钟）、高效点评（15分钟）,（1）基因工程的三种基本工具及其作用,（4）【课堂检测】6、7,（2）基因操作的基本程序,（5）【课堂检测】8、9,（3）【课堂检测】1、4、5,5组,6组,1组,2组,3组,（6）【课堂检测】10,4组,1组,2组,3组,4组,5组,6组,踊跃展示（5分钟）、高效点评（15分钟）,（1）三种基因操作工具及其作用,（4）【课堂检测】4、5,（5）【课堂检测】6,（3）【课堂检测】1、3,1组,2组,3组,4组,5组,6组,8组,9组,7组,（6）【课堂检测】7,（7）【课堂检测】8,（8）【课堂检测】9,（9）【课堂检测】10,6组,7组,8组,9组,1组,2组,3组,4组,5组,（2）基因操作的基本程序,【课堂检测】参考答案,19、CCADBDDDD,（3）可以连接，因为两种限制性内切酶切割后所形成的黏性末端是相同的（可以互补的）。,10、（1）,（2）,【合作探究】参考答案,1、不能。因为一般基因有上千个碱基对。2、可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。,ATAGCATG