DNA的粗提取与鉴定1

DNA和蛋白质技术,DNA的粗提取和鉴定,讨论3：如何证明他们是遗传物质？,讨论2：构成生物体的遗传物质是什么？,讨论1：什么是生物大分子？,主要指蛋白质、核酸和多糖等,知识回顾,讨论4：提取生物大分子的基本思路?,选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,讨论6：提取DNA的基本思路？,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分,（一）DNA的提取原理,1、DNA在盐溶液中的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的_溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的_就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。,NaCl,盐浓度,阅读P5455相关内容，找出提取和纯化DNA的原理有哪些？,基础知识,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于_时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而_；在_时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又_。,0.14mol/L,逐渐降低,0.14mol/L,逐渐增大,思考：,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为_时，DNA的溶解度最大，浓度为_时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。,2mol/L,0.14mol/L,DNA不溶于_，但是细胞中的某些蛋白质则可以溶于其中。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步分离，从而提纯DNA。,酒精溶液,2、DNA在酒精溶液中的溶解性,DNA,蛋白酶能水解蛋白质，但是对_没有影响。,大多数蛋白质不能忍受6080的高温，而DNA在_以上才会变性。,洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除_和_,但对DNA没有影响。,利用以上原理可以将DNA与蛋白质进一步分离。,80,脂质,蛋白质,3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,洗涤剂是离子去污剂，能够瓦解细胞膜，有利于DNA的释放。洗涤剂瓦解细胞膜的过程是乳化作用。乳化作用是将一种液体分散到第二种不相溶的液体中去的过程，最大一类的乳化剂是肥皂、去污粉和其他化合物，其基本构造系末端是极性基团的烷烃链，可以将脂质乳化为形成较小的脂质微粒。,在_的条件下，DNA与_反应呈蓝色。,紫外灯照射法。,A、用蒸馏水配制万分之五的溴化乙（EB）染色剂。,B、将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上，再滴一滴EB溶液染色。,C、将蜡纸放在紫外灯(260nm)下照射（暗室中），可见橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260nm处),甲基绿可将DNA染成_。,（二）DNA的鉴定原理,沸水浴,二苯胺,绿色,（一）实验材料的选取,2、供选材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,1、选取材料的原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对_的生物组织，成功的可能性更大,较高,实验设计,能否选用哺乳动物成熟的红细胞？,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞的破碎和DNA的收集方法。,动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的_，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。,为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,蒸馏水,思考：,植物细胞（如洋葱）需要先加入一定的_和_进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。,1、加入洗涤剂和食盐的作用分别什么？,洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。,洗涤剂,研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,2、如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,食盐,2、植物细胞的破碎和DNA的收集方法。,思考：,（三）去除滤液中的杂质,经过上述步骤获得的滤液中可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质，因此为了_提取的DNA需要将滤液作进一步处理。,纯化,请对下面除去杂质的三个方案进行讨论：,方案一：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L,过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,思考：,方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。,方案三：将滤液放在6075的恒温水浴箱中保温1015min,注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀析出而DNA分子还未变性，可以将DNA与蛋白质分离。,思考：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开。,方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,（四）DNA的析出与鉴定,阅读P56内容，回答相关问题：,1、DNA的析出,将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的_（体积分数为95），静置23min，溶液中会出现_，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿_搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。,冷却的酒精溶液,白色丝状物,一个方向,说明：预冷的乙醇溶液具有以下优点：1、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解。2、降低分子运动，易于形成沉淀析出。3、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。,2、DNA的鉴定,取两只试管，分别加入物质的量浓度为_mol/L的NaCl溶液5ml，编号A、B；在A试管中加入DNA丝状物，玻璃棒搅拌，使其溶解，B试管_；两只试管各加入_试剂4ml，混合均匀；将试管置于_中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化；A试管溶液颜色_，B试管溶液颜色_。,2,二苯胺,沸水,蓝色,无变化,不加,鸡血细胞液中DNA的粗提取实验流程图,活鸡鲜血经分离或沉淀获得血细胞,低渗处理，获得血细胞核，滤液中含DNA和其他核物质。,滤液2mol/L的NaCl溶液40mL，玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶解核内的DNA，滤液中含DNA,在上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并沿一个方向轻轻搅拌，出现丝状物；当丝状物不在增加时，停止加水（此时NaCl溶液的浓度相当于0.14mol/L）。,5、过滤取纱布上的滤物,纱布过滤,6、再次溶解DNA,2mol/LNaCl溶液,取滤物,用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上。,在20mL烧杯中轻缓搅拌3min，使尽可能多的DNA溶解在NaCl溶液。再过滤（提纯）。,7、加冷酒精使DNA析出（纯化）,冷酒精,步骤所得的滤液体积分数为95%的冷却酒精50mL，用玻棒沿一个方向轻缓搅拌，溶液中（析出）出现乳白色丝状物，用玻棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。去杂质、DNA凝集。,对照条件现象,1、观察提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；,（一）是否提取出了DNA,2、二苯胺鉴定出现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,（二）分析DNA中的杂质,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,结果分析与评价,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料；其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，对比观察哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好,操作提示,1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,二苯胺试剂的配制称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。,课题延伸,本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。,1.下列关于DNA粗提取与鉴定的说法正确的是A氯化钠的浓度越低，对DNA的溶解度越大B人血也可代替鸡血进行实验C柠檬酸钠的主要作用是加速血细胞破裂DDNA不能溶于酒精,课堂练习,2.在破碎鸡血细胞时，要先加入20ml的蒸馏水，其作用是A.DNA溶解于水B血细胞破裂，DNA释放C稀释血液，防止凝固D有利于搅拌,3.若选择的实验材料为植物细胞，破碎细胞时要加入一定量的洗涤剂和食盐，加入食盐的目的是A.利于DNA的溶解B.分离DNA和蛋白质C.溶解细胞膜D.溶解蛋白质,4.在DNA粗提取实验中，向在溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是A有利于溶解DNA