基因工程操作的基本程序.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。(种类见P9),基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因。,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法：,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(一)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？什么是基因组文库？什么是部分基因文库？怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？目的基因的有关信息与什么相联系？,1、概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。,基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。,见P10“生物技术资料卡”,2、基因文库种类,3.基因文库的目的,构建基因文库是获得目的基因的方法之一，并不是唯一方法。如果所需的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需的目的基因的序列完全不知，或者只知道目的基因序列的一段，或者想从一种生物中获得更多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就要构建基因文库。总之，为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。,4.获取目的基因的根据（P9）,依据：目的基因的有关信息。如：根据,基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性。,5、基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当限制酶切割,许多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,与载体连接导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA(cDNA),该生物cDNA文库,1、概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,2、原理：,DNA复制,（二）利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA(需含有目的基因),4、条件：,一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。,3、前提：,温度控制,IMN,变性,复性,延伸,变性,1、变性(90-95度)：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2、复性（55-60）：引物与两条单链通过碱基互补配对原则结合；3、延伸（70-75）：在DNA聚合酶（Taq酶）作用下，从5端3端进行延伸。,5、扩增过程,利用PCR技术扩增目的基因,（三）通过DNA合成仪用化学方法人工合成,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,DNA合成仪,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。（2）用_切断目的基因，使其产生_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1、过程:,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,质粒,目的基因,限制酶,2、基因表达载体的组成：,3、目的：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,e、复制原点,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1、将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞