《DNA操作技术》PPT课件

,第四章,DNA操作技术,DNA操作技术主要有：切割、连接、缩短、加长、转录成RNA，或者合成新的DNA，化学修饰、或者去掉特殊的化学基团。这些分子操作技术，不仅是基因克隆的基础，也是研究生物化学、基因结构、基因表达调控研究的基础。,学习内容：,DNA操作酶核酸酶连接酶聚合酶DNA修饰酶限制性内切酶分类和命名酶切体系、反应条件、结果鉴定定位酶切位点连接,1.DNA操作酶,核酸酶：剪切、缩短、降解核酸Bal31E.coli外切酶IIIS1内切酶DNaseIRNaseH连接酶：连接核酸分子聚合酶：复制修饰酶：增加或去除化学基团拓扑异构酶：引入或去除超螺旋的闭合环状DNA,1.1核酸酶,作用：降解磷酸二酯键分为：外切酶内切酶,1.1核酸酶,Bal31(来自于细菌Alteromonasespejiana)单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性。依赖于Ca2+用途：构建限制酶图谱产生末端缺失突变DNA超螺旋线性化,1.1核酸酶,E.coli外切酶III只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。,1.1核酸酶,来自于真菌Aspergillusoryzae的S1内切酶作用于单链DNA或RNA。pH4.0-4.3,Zn2+用途：分析内元的位置获得平端ds-DNA酶量大时，降解双链DNA,1.1核酸酶,来自于牛胰腺的DNaseI既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链。,1.1核酸酶,RNaseH（E.coli）降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。,1.2连接酶,广泛存在于各种生物中，连接3端羟基和5端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复制、修复、以及体外重组过程中起重要作用。,1.2连接酶,T4-DNA连接酶连接粘性末端、平端修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。E.coliDNA连接酶连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成）T4-RNA连接酶,1.3聚合酶,依赖DNA的DNA聚合酶不依赖DNA的DNA聚合酶（末端转移酶）依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）依赖DNA的RNA聚合酶不依赖DNA的RNA聚合酶,1.3聚合酶,DNA聚合酶I5-3聚合酶活性3-5外切酶活性5-3外切酶活性核酸内切酶活性可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5-3外切酶活性的分子。,1.3聚合酶,1.3聚合酶,Klenow酶修复限制性内切酶造成的粘端标记DNA探针催化cDNA第二条链的合成末端终止法测序,1.3聚合酶,T4DNA聚合酶与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。T7DNA聚合酶测序酶TaqDNA聚合酶,1.3聚合酶,逆转录酶：将mRNA转录成cDNAAMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）DNA聚合酶活性RNaseH活性DNA内切酶活性核酸结合活性M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）,1.3聚合酶,两种逆转录酶的区别肽链的组成禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNaseH活性鼠酶1条，较弱的RNaseH活性反应的最适温度禽酶42C，二级结构丰富RNA，禽酶效率高反应的最适pH值禽酶pH8.3鼠酶pH7.6,1.4DNA修饰酶,碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5端的磷酸基团。polynucleotidekinase:来自于T4侵染的大肠杆菌，在5端增加磷酸基团。末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。甲基化酶具有完全相同的识别序列。,1.4DNA修饰酶,甲基化酶:大肠杆菌中的甲基化酶dam甲基化酶在5GATC3的腺嘌呤N6位上引入甲基，可使一些识别顺序中含有5GATC3的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如BclI（TGATCA），但BamHI（GGATAA）则不会因为N6A的甲基化而失去活性。dcm甲基化酶此酶在序列5CCAGC3或5CCTGG3中间的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoRII,1.4DNA修饰酶,甲基化酶在基因工程中用途许多II类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使免受切割。如：M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA免受EcoRI的切割。,1.4DNA修饰酶,末端脱氧核苷酰转移酶（TDT）3端突出的双链DNA，Mg2+平端或3凹端的低物，Co2+,1.4DNA修饰酶,T4-多核苷酸激酶（T4-PNP）将-磷酸转移到DNA或RNA的5端放射性标记DNA的5端连接反应中，使缺少5端磷酸的DNA片段和接头磷酸化,1.4DNA修饰酶,碱性磷酸酶（BAP,CIP）作用于载体的5端，提高重组效率作用于外源DNA的5端，防止自连,1.5拓扑异构酶,在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋在EDTA溶液中也有活性,2限制性内切酶,2限制性内切酶,RestrictionEndonuclease催化双链DNA分子的断裂，产生限制性片段。不同来源的DNA具有不同的酶切位点以及不同的位点排列顺序，因此各种生物的DNA均呈现特征性的限制性酶切图谱。在生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事诊断以及基因重组领域起重要作用，并誉为“分子手术刀”。,2限制性内切酶,2.1限制性内切酶的发现,早在二十世纪五十年代发现一些细菌对噬菌体具有免疫性，称为寄主控制的限制。限制的出现因为在噬菌体复制合成新的颗粒之前，细菌就产生酶降解噬菌体DNA,而细菌自身的DNA分子的酶识别位点已被甲基化修饰，这种酶被称为限制性内切酶。1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础,2.2限制性内切酶分类,限制性核酸内切酶可分为三大类：I类II类*III类,I类限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。代表EcoB、EcoK,(II型)限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。,III型限制性内切酶,有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。,2.3限制性内切酶的命名原则,命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。PvuI识别CGATCG，PvuII识别CAGCTG,都来自于Proteusvulgaris。HindIII是在Haemophilusinfluenzaed株中发现的第三种酶。,2.3限制性内切酶的命名原则,EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。许多内切酶识别6碱基序列，也有的识别4、5、8核苷酸序列Sau3A来自于Staphylococcusaureus品系3A，识别GATC。也有一些酶识别兼并序列，如HinfI来自于Haemophilusinfluenzae品系Rf，识别GANTC，N代表A,G,T,C。,2.4限制性内切酶产物,钝端（平端）粘性末端,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：5GAT|ATC33CTA|TAG5切割后形成5GAT和ATC3、3CTA和TAG5。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,2.4限制性内切酶产物,同位酶（Isoschizomers）:识别序列相同但切点不同的酶。HpaII和MspI都识别5GGCC3，如其中有5甲基胞嘧啶，则只有HpaII能切割。同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。,2.4限制性内切酶产物,同裂酶（同切酶或异源同工酶）：识别位点与切割位点均相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。Hpa和Msp的识别顺序都是5GCG_G3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。,2.4限制性内切酶产物,2.4限制性内切酶产物,星号活力（第二活性）PH离子强度甘油浓度过高10%时酶量限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。,2.5DNA分子中识别位点的数目,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列。DNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点。如BglII只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个，意味着DNA中GC含量少于50%。这种方法只能粗略的估计，只有实验能确定到底有多少个识别位点。,2.6反应程序,体系：DNA分子（溶液）酶缓冲液（一般pH值7.4,含Mg2+,NaCl,还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止失活）水1U定义为在最佳缓冲系统和20ul体积中反应1小时，完全水解1gDNA所需的酶量反应条件一般为37C，也有例外，如TaqI在65C时活性最高。,2.6反应程序,1）加入DNA2）加入Buffer3)加入酶4）37C保温1hr或过夜5)反应终止，70C加热、加入EDTA、或加入苯酚,2.7酶切结果分析,通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。琼脂糖凝胶电泳,Standardelectrophoresis(a)doesnotseparateDNAfragmentsofdifferentsizes,whereasgelelectrophoresis(b)does,2.7酶切结果分析,DNA分子的检测EB染色，DNA分子小于25ng，很难检测到放射性自显影。可检测2ngDNA。,2.7酶切结果分析,0.5g的1kbDNALadder0.8%TAE琼脂糖凝胶，EB染色,2.8估计DNA分子的大小,D=a-b(logM)D:移动距离，M:分子量，a,b是恒量。与已知大小的片段进行比较，误差约5%。,Figure4.16EstimationofthesizesofDNAfragmentsinanagarosegel.,Figure4.17UsingarestrictionmaptoworkoutwhichrestrictionendonucleasesshouldbeusedtoobtainDNAfragmentscontainingindividualgenes.,2.9绘制DNA分子的酶切图谱,确定每一种酶切后产生片段的分子量和数目。进行双酶切。比较单酶切和双酶切结果，绘制酶切图谱。含糊的位点可以通过部分酶切解决。,绘制酶切图谱,绘制酶切图谱,绘制酶切图谱,2.10多酶联合酶解,对离子强度要求相同的酶，可同时酶解。对离子强度要求不同的酶：低盐浓度的酶先切，后补加NaCl一种酶切后，沉淀DNA，换缓冲液。,Figure4.19Ligation:thefinalstepinconstructionofarecombinantDNAmolecule.,Figure4.20ThedifferentjoiningreactionscatalysedbyDNAlligase.,外源DNA与载体DNA的连接,相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘性末端的更换,3.1相同粘性末端的连接,来源相同的酶同尾酶问题极性有两种可能同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。,BamHI识别顺序5G|GATCCG|GATCC3CCTAG|GCCTAG|GBglII的识别序列5A|GATCTA|GATCT3TCTAG|ATCTAG|AAGATCCGGATCTTCTAGGCCTAGA,EaeI的识别序列PyGGCCPu(Py表示嘧啶，Pu表示嘌呤）EayI的识别序列CGGCCG连接后重组分子仅能为EaeI识别。,3.2平头末端的连接,粘性末端-分子内部连接，平头末端-分子间的连接。提高连接效率的方法：加大酶用量（10倍）加大平头末端底物的浓度加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用加入单价阳离子，150-200mMNaCl提高反应温度平头连接同样存在两种极性,3.3不同粘性末端的连接,突出5末端Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接突出3末端T4-DNApol切平，然后平头连接突出末端不同Klenow补平，或S1核酸酶切平连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII（XbaI恢复），XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与BglII（产生ClaI位点）,3.4人工粘性末端的连接,5突出的末端外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。3突出的末端外源片段先用TdT加polyG；载体片段加polyC；然后退火；再用Klenow补齐