1细胞工程简介ppt课件

细胞工程CellEngineering,5/11/2020,Cellengineering,2,课程内容,第一章细胞工程基础第一节细胞工程简介第二节细胞培养要求-实验室条件、常用培养液及其配制第二章动物细胞培养第一节概论第二节基本技术第三章植物细胞培养第一节概论第二节一般过程第四章细胞融合第一节概述第二节杂交瘤技术第三节植物细胞的融合第四节微生物细胞融合第五章生物制品生产第一节细胞的大规模培养第二节动物细胞制药第三节植物细胞次生代谢产物的生产第六章细胞组织修复-干细胞,5/11/2020,Cellengineering,3,主要参考教材,李志勇编著细胞工程学高等教育出版社殷红主编细胞工程化学工业出版社罗立新编著细胞工程华南理工大学出版社司徒镇强主编细胞培养世界图书出版公司李胜主编植物组织培养原理与技术化学工业出版社,5/11/2020,Cellengineering,4,第一章细胞工程基础,目的与要求1.明确细胞工程的概念、主要内容、学习目的。2.掌握细胞工程的基本要求。难点细胞的无菌操作,5/11/2020,Cellengineering,5,第一节生物工程简介,众所周知，生物工程是目前乃至今后发展最快、研究最深、效果（经济和科技）最好的科学技术，也是我们听得最多的、见得最多的、用得最多的，都与以前和现在的生物技术相关。请同学们想想自己身边的生物技术？,5/11/2020,Cellengineering,6,青霉素的产生1928年英国人弗莱明，首先发现青霉真菌能产生青霉素。对青霉真菌代谢产物青霉素大规模的培养、提取作为药物使用。此生产思路沿用至今。目前常用的微生物制药，研究和发现新的次生代谢产物用于我们的医疗和保健。1.错误不是错！2.仔细、好奇、详细记录3.自然界中存在着相生相克的物质。,青霉属,（Penicillium）是一类真菌的总称。半知菌类，串珠霉目的一属。菌丝为多细胞分枝。无性繁殖时，菌丝发生直立的多细胞分生孢子梗。每枝顶端有2-3个瓶状细胞，其上各生一串灰绿色分生孢子。常见于腐烂的水果、蔬菜、肉食及衣履上，多呈灰绿色。有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。,5/11/2020,Cellengineering,8,无籽西瓜的培育无籽西瓜吃起来甜、沙且不用吐籽，比较方便！无籽西瓜的培育过程就是运用细胞工程的杂交技术多倍体育种（三倍体）。利用杂交优势生产各种各样的抗病、耐旱、抗逆、成份特异的产品。,5/11/2020,Cellengineering,9,克隆技术1997年，Wilmut等人利用成年绵羊乳腺上皮细胞核移入去核卵母，成功克隆出了小绵羊“多莉”，从此，克隆技术成了生物科学中的一个新里程碑。各种克隆动物从此开始陆续登台。,5/11/2020,Cellengineering,10,5/11/2020,Cellengineering,11,1998年2月，英国宣布克隆出牛犊“杰弗逊”；1998年7月，日籍科学家成功地得到3代克隆小鼠，这是首次用克隆动物克隆出动物；2001年1月，美国克隆恒河猴成功，命名为“泰特拉”，这意味着克隆人不存在技术障碍；2002年3月，美国科学家克隆成功猫；2005年4月，韩国克隆出狗“首努比”(Snuppy)，2008年9月4日通过双亲克隆狗生产狗宝宝，证明克隆狗有繁殖能力。”,5/11/2020,Cellengineering,12,人造器官1998年，一只背上长着人耳朵的老鼠震撼了全世界；2001年，一个颅骨破损达66厘米的男孩，在上海用人工颅骨修补成功。奇迹的创造者是中国科学家曹谊林。,5/11/2020,Cellengineering,13,造血干细胞癌症的治疗是非常困难的。白血病的治疗采用造血干细胞的制取与培养。这项技术是目前干细胞研究最成熟、最具实用价值的成果。,基本过程：1.化验病人的白细胞抗原。2.寻找白细胞抗原类似的健康人，7595%同源率。3.病人化疗杀死自身的癌细胞后，进入无菌移植仓。4.供体健康人注射干细胞生长因子，刺激机体产生大量幼稚造血干细胞。5.对供体的全身血液过滤，将造血干细胞收集，2-4h移植到病人体内。6.病人在移植仓内，直至供体造血干细胞归巢到骨髓能产生各种血液细胞，移植初步成功。,5/11/2020,Cellengineering,14,试管婴儿利用细胞体外融合，试管婴儿的培养是卵细胞与精子在体外合适的条件下结合发育形成胚胎，满足不孕夫妇对孩子的渴望！这项技术的成本很低，但对于不孕夫妇就是价值连城的！而且，也是目前医疗中，最安全、最有成就感、最受人欢迎的治疗手段！因为，其他所有的治疗都有损伤、死亡、痛苦，而这项技术是健康和生命，尤其是对喜爱孩子的家庭来说，只有得到没有失去！,5/11/2020,Cellengineering,15,干扰素干扰素是我们机体免疫细胞产生的少数几种能抵御病毒的天然防御物质(还有转移因子和胸腺肽)之一。是两位美国科学家在1957年研究病毒的干扰现象时发现的，但人体内产生的数量非常小，所以价格十分昂贵。,1980年，由美国生物化学家博耶和科恩创建的基因工程公司，通过各种不同基因组合得到几株生产干扰素的细菌。12天内每个菌体能产生20万个干扰素分子。爱尔兰先灵葆雅公司生产的干扰素-2b，1.2mL含1800万IU，每支1235元(90个菌/1-2天)，每个细菌1天产值6.86元，计算公司产值和利润？,5/11/2020,Cellengineering,17,一、生物工程的概念和组成,生物工程是以现代生命科学为基础，应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。,5/11/2020,Cellengineering,18,生物工程的组成,一般认为由四大部分组成：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程，后来生物化学工程和蛋白质工程也被列入生物工程的范畴。因此，现代生物工程包含了以上六大领域的内容。生物技术相关的行业涵盖了许多行业。,5/11/2020,Cellengineering,19,5/11/2020,Cellengineering,20,二、细胞工程的概念,指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按人们的意愿来改变细胞内的遗传物质并使之增殖，以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。,5/11/2020,Cellengineering,21,细胞工程与其它生物工程的关系,5/11/2020,Cellengineering,22,三、细胞工程的基本内容,细胞工程包括四方面的主要技术。动植物细胞和组织培养、细胞融合（也称体细胞杂交）、生物制品的生产（动物、植物、微生物）、染色体工程（向细胞内引入高分子物质）,5/11/2020,Cellengineering,23,5/11/2020,Cellengineering,24,5/11/2020,Cellengineering,25,5/11/2020,Cellengineering,26,细胞工程是一个非常年轻富有活力的学科。在它诞生的100多年时间里，细胞工程技术已经成为世界经济中最具活力的支柱性产业，产生了巨大的经济效益和社会影响。随着生命科学的不断深入，细胞工程技术会得到更快的发展，在解决人类的资源与环境等重大问题上大要作为。,5/11/2020,Cellengineering,27,第二节细胞培养的基本要求,一、实验室基本条件二、常用培养液及其配制,5/11/2020,Cellengineering,28,一、实验室基本条件,实验规划实验设备实验室器械和器皿,5/11/2020,Cellengineering,29,1准备室是培养用具清洗、消毒和作实验准备的场所。必须具备的物品：两处水槽：实验后的清洗及清洁液浸后的清洗。盛清洁液的陶瓷缸或玻璃缸。清洗后器皿的凉干架和贮存柜。高温干燥消毒箱和高压蒸汽消毒锅。消毒后器皿的凉干架和贮存柜。,5/11/2020,Cellengineering,30,重蒸水装置。包装器皿的工作台。污物桶。有条件时可设个通风排气柜，有毒性气体时用。2缓冲间保护操作室的无菌环境，避免空气对流。一般以走廊代替。,5/11/2020,Cellengineering,31,3培养室完全密闭，保持恒定的温度；最好设在阴面，阳光不能直接照射，防止室温增高；天花板高度不超过2米，保证紫外灯有效杀菌；门一般用拉门，以防止空气流动。天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要涂漆，便于清洗和消毒，也不易在墙角堆积灰尘。,5/11/2020,Cellengineering,32,实验室设备无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，磁力搅拌器，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器细胞保存条件：液氮罐,5/11/2020,Cellengineering,33,风淋室风淋室是生物洁净室的理想配套设备，不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。吹淋口方向可调，风淋室可以配合加热器，冬天可以加热，温度可调，一般控制温度在30-35较为适宜。,5/11/2020,Cellengineering,34,传递窗主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。,5/11/2020,Cellengineering,35,5/11/2020,Cellengineering,36,落下菌数：0（隔离环境），3（屏障环境），30个/皿（普通环境）在正常状态下，每510m2上，放置1个直径9cm的血琼脂培养皿，暴露30min，培养48h的菌落数。,5/11/2020,Cellengineering,37,超净工作台超净工作台是利用鼓风机，将室内空气经过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器送出的洁净气流，从一定方向均匀的断面风速通过操作台，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。根据空气层流方式的不同，超净工作台主要分为两种：水平层流式；垂直层流式。,5/11/2020,Cellengineering,38,无菌手术室主要用于动物取材和动物实验的手术操作。完全按照外科手术室的要求，配备大、小动物手术台、无影灯、托盘车、拖鞋、口罩和工作服等常用物品。,5/11/2020,Cellengineering,39,CO2培养箱一定浓度（5%）的CO2。可维持培养液恒定的pH。箱体内装有水浴，可增加湿度。内装有紫外灯。可调节CO2和空气的比例。,5/11/2020,Cellengineering,40,CO2培养箱,应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。箱内放置灭菌蒸馏水3000毫升，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,细胞生长条件,5/11/2020,Cellengineering,41,电热干燥箱用于烘干和干热灭菌消毒玻璃器皿。消毒时，温度高达160，维持90120分钟，因此，消毒过程中一般不要随意打开箱门，以免玻璃器皿突然遇到冷空气而破裂，包装器皿的纸容易燃烧，要等温度降低到50以下时，才能打开箱门。,干热消毒（160，2小时），主要用于玻璃器皿消毒。,5/11/2020,Cellengineering,42,蒸汽消毒器一般细胞培养实验室消毒工作量大，常用的为立式或柜式的大消毒机。,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,5/11/2020,Cellengineering,43,磁力搅拌器适用于粘稠度不是很大的液体搅拌或同时加热。利用磁场和漩涡原理，用搅拌子旋转带动液体，达到搅拌液体的目的。,5/11/2020,Cellengineering,44,冰箱常用冰箱为4-20，适于储存培养液，生盐水，Hanks液、试剂等培养用物品及短期保存组织标本。-70-80的超低温冰箱，冷冻保存生物活性及较长时间存放的制剂，如酶、血清等。细胞培养冰箱最好是专用。离心机一般小型台式离心机即可，如开展分子生物学研究如细胞脱核、DNA、RNA抽提等，则需高速、大容量和能进行调温的高档微型离心机、冰冻高速离心机等。制备血清需要高速（5000转/分钟）水平离心机。,5/11/2020,Cellengineering,45,高速离心机,超速离心机,细胞检测条件,5/11/2020,Cellengineering,46,蒸馏器组织培养对水的质量要求极高，一般都要用三次蒸馏的水，各种培养基及缓冲液的配制要用四蒸水，且现蒸现用，不宜使用存放数日的蒸馏水。目前国内多使用自动双重纯水蒸馏器（石英管加热），不可采用普通自来水蒸馏，一般用纯水蒸馏。滤器是细胞培养中关键的器械。分三种：玻璃滤器：基本不用。蔡氏滤器：一种金属滤器，用于量大的溶液过滤。微孔滤膜滤器：金属或塑料结构，中间为一种一次性的物制混合纤维素滤膜。速度较快，效果较好，但使用比较繁琐，拆装、清洗、监测和消毒。,5/11/2020,Cellengineering,47,自动双重纯水蒸馏器纯水仪,细胞生长条件,5/11/2020,Cellengineering,48,Zeiss滤器：大多数培养用液过滤除菌均采用滤过法除菌。,微孔滤膜滤器,5/11/2020,Cellengineering,49,液氮罐用来储存细胞的容器，液氮温度可达-196，可长期保存细胞约一年左右。显微镜常用倒置显微镜观察细胞：一是了解细胞生长情况，二是检查是否发生污染。需购买质量较好并带有长焦距相差装置和摄影或摄像装置的倒置显微镜，如附有荧光装置则更为理想。天平细胞培养配置溶液一般使用精确到万分之一克（0.1mg）的电子分析天平。酶标仪用于细胞活力监测和生长曲线的制作。,5/11/2020,Cellengineering,50,实验室器械和器皿1.金属器械主要是用于解剖动物、取材和原代动物切割组织。一般配置34套以上，操作前灭菌，用时随时拿取，每次一套。常用的有：解剖刀、解剖剪（尖头和圆头）、眼科剪、镊子（平头和尖头）、缝合针、持针器、止血钳、巾钳、骨剪、骨针等。各种金属器械使用后，要及时刷洗干净，再用洒精棉球擦拭晾干，张开刀口，以防生锈。,5/11/2020,Cellengineering,51,5/11/2020,Cellengineering,52,2.玻璃器皿培养瓶：玻璃瓶：培养皿：吸管：抽滤瓶：量桶：消毒筒：匀浆器：离心管：溶液瓶等等。3.其它杂品洒精灯，煮沸锅，铝饭盒，胶塞，胶帽，拖鞋，洗衣机，金属筐，盆，器械托盘等等。,5/11/2020,Cellengineering,53,移液器,细胞检测条件,5/11/2020,Cellengineering,54,二、常用培养液及其配制,1.细胞培养条件无污染环境条件：无毒和无菌是首要条件。培养温度：人和动物细胞以3537最适。对低温的耐受性要好。pH值：最适7.27.4，不超过6.87.6。缓冲系统：常用磷酸盐缓冲系统（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠），通入CO2。也用HEPES（二羟乙基哌嗪乙烷磺酸），25mmol/L，能稳定和快速地抵抗pH的变化。,5/11/2020,Cellengineering,55,气体环境细胞的生长需要CO2和O2参与。CO2作为代谢产物起到调解pH的作用，若容器内CO2散失后，会使培养液pH升高。因此，CO2培养箱提供一定比例的CO2气体，使培养环境中的氢离子浓度保持稳定，pH范围恒定。,5/11/2020,Cellengineering,56,营养条件能进入细胞、被细胞利用，参与代谢活动的物质都是营养物质。主要有以下几个方面：碳素营养、氨基酸类、维生素类、无机盐、矿物类、激素、生长因子及其它有机物。,5/11/2020,Cellengineering,57,2.动物细胞的培养液,1）培养液的成分尽可能与体内生活条件相接近，如温度、渗透压、pH、营养成分、激素等，满足上述的7个条件。2）培养液的类型常用三大类培养液：平衡盐溶液（BSS）、天然培养基、合成培养基。3）其他常用培养液消化液抗菌素谷氨酰胺等。,5/11/2020,Cellengineering,58,（1）平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）主要有无机盐和葡萄糖组成。BSS液中常用0.0010.005%的酚酞做指示剂：pH7.4红色、pH7.6蓝红色、pH7.0橙色、pH6.5黄色。BSS常用作冲洗组织和配制培养液的基础溶液。Ca2+和Mg2+是细胞膜的重要成分，它们会凝聚细胞，因此，配制溶液时不能含有两类离子，如：D-Hank液。,5/11/2020,Cellengineering,59,5/11/2020,Cellengineering,60,细胞培养用液的配制（PBS）水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml,细胞生长条件,5/11/2020,Cellengineering,61,（2）天然培养液直接从动物体采取血液或组织液一定成分作为培养液，天然培养液营养成分丰富，但成分复杂，来源有限。a.血清能供给细胞营养成分，促进细胞合成DNA，促进细胞增殖。是最常用、最有效的天然培养液，含有许多不可缺少的未知成分。常用犊牛血清、胎牛血清等，来源困难，价格昂贵。b.胶原从动物真皮中提取，它是细胞生长的良好基质，促进组织细胞的贴壁，改善生长表面特性。常用大鼠尾巴的筋腱、牛真皮等。,5/11/2020,Cellengineering,62,（3）合成培养液人工模拟体内相似的生长环境而配制。a.含血清培养液加入一定量的血清，以克服合成培养基的不足。常用的有：M199（Morgen1952年研制的）、DMEM(DulbeccomodifiedEaglemedium)、F-10(Ham1962年针对小鼠细胞培养用)、RPMI1640(MOOR等研制的适合多种细胞生长的应用最广泛的培养基之一)。b.无血清培养液血清对细胞生长有效但其成分复杂，特别是易带入动物疾病。为了深入研究细胞生长发育、分裂及衰老的生物学机制，人们研制了无血清培养基。,5/11/2020,Cellengineering,63,3）其它常用溶液,消化液在细胞培养前，把组织块解离成单个细胞或传代培养时，使细胞脱离贴壁器皿的表面并分散解离的溶液。常用有3种：胰蛋白酶液来自动物胰脏黄白色粉末。常用0.25%和0.125%，温度37、pH7.4左右。Ca2+能干扰胰酶的活性，加少量含钙的血清可终止酶的消化作用。,5/11/2020,Cellengineering,64,胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质的蛋白质水解而使细胞分散开。常用的市售胰蛋白酶活力为1：125或1：250（也就是说，1份胰蛋白酶可解离125份、或250份酪蛋白），在37、pH8.0时活力最强。实际应用中，可根据组织的疏松和结构不同，采用冷消化（4）或热消化（室温、37）。,5/11/2020,Cellengineering,65,EDTA溶液是一种化学螯合剂，与细胞环境中Ca2+、Mg2+等形成螯合物，破坏组织完整性，从而使细胞分离。与胰蛋白酶合用可提高消化效率。常用D-Hank配成0.2%的EDTA使用。胶原蛋白酶液主要水解细胞间质的脯氨氨酸多肽，使细胞离散，对细胞损伤弱。消化后要充分漂洗去除，一般用于特殊种类的细胞消化（常用于消化上皮细胞）。,5/11/2020,Cellengineering,66,抗菌素液抑制培养液中可能出现的细菌和真菌的污染。常用终浓度为100u/mL的青、链霉素；50g/mL的卡那霉素；25u/mL的制菌霉素。谷氨酰胺溶液谷氨酰胺易被破坏而失效，一般添加至200mmol/L谷氨酰胺溶液。肿瘤细胞比正常细胞对谷氨酰胺需求量高1倍。,5/11/2020,植物细胞培养,67,3.植物细胞培养基,培养基（medium）的主要成分,5/11/2020,植物细胞培养,68,生长调节剂的特点,5/11/2020,植物细胞培养,69,生长素和分裂素添加原则,生长素和分裂素添加比例调控离体细胞的脱分化和再分化。细胞分裂素和生长素相对平衡诱导愈伤组织形成；生长素水平较高诱导根发生；分裂素水平高于生长素水平诱导芽分化。,5/11/2020,植物细胞培养,70,植物培养基的配制,(1)水和药品采用蒸馏水或无离子水，药品最好采用分析纯。(2)母液的配置先将培养基的各种成份分类配成浓缩的母液，正式配制时再按规定用量稀释、混合。(3)制备培养基a混合各成分母液b熔化琼脂搅拌混匀调pH值分装灭菌备用(4)培养基的消毒主要有高温高压灭菌(耐热)和过滤灭菌(热敏)两种。,5/11/20