课题3　血红蛋白的提取和分离 (2)

课时1,血液,血浆,水分,固体物质,血浆蛋白,无机盐磷脂葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（）,两个a肽链,两个一肽链,共四条肽链,90,血红蛋白与红细胞,1、血红蛋白与红细胞关系,血红蛋白与红细胞,1、血红蛋白与红细胞关系2、血红蛋白,每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。,一个亚铁血红素基团,一分子氧或一分子二氧化碳,血红素,思考、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人(猪、牛、羊）的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,思考、分离生物大分子的基本思路是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,思考、蛋白质的分离和提取的原理是什么？,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。,思考、高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,本课题学习目标,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝胶色谱法电泳法缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：样品的处理色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,一、基础知识：,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：（学生自主学习，再共同探究）,1、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,4、具体过程,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,(二)缓冲溶液：,2、作用：能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。,外界的酸或碱,PH值,3、缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,12,使用比例,在不同PH范围内,思考：说出人体血液中缓冲对。,NaH2PO4/Na2HPO4,H2CO3/NaHCO3,（三）电泳：,1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,思考：在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？,使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）,2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有()在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,分类：,琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。,测定（）通常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳,蛋白质相对分子质量,二、实验操作,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,1.样品处理,血液,血浆,血细胞,白细胞,血小板,红细胞（最多）,血红蛋白（）,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,90,水分,固体物质,（血浆蛋白）,目的：去除（）方法：（）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）,(1)红细胞的洗涤,杂质蛋白,低速短时间,黄色血浆,暗红色,烧杯,1.样品处理,红细胞的洗涤-,血红蛋白的释放-,分离血红蛋白溶液,再加入用（）的（）即质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤低速离心（低速短时间）,重复上述步骤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。,五倍体积,生理盐水,三,黄色,（2）血红蛋白的释放,加（）到（）体积，再加40体积的（）（溶解细胞膜），置于（）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.,(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:,原血液,甲苯,磁力搅拌器,蒸馏水,目的：使红细胞破裂，血红蛋白释放,第1层（最上层）：（）甲苯层,第2层（中上层）：（）的沉淀层，（）色薄层固体,第3层（中下层）：（）的水溶液层（）的液体,第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层,无色透明,脂溶性物质,白,血红蛋白,红色透明,暗红色,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,原理：课本图解，思考？取()ml的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用硝酸纤维