环境工程微生物学十三-微生物学新技术在环境领域的应用

第十一章微生物学新技术在环境工程领域的应用,微生物学新技术包括：遗传工程（诱变育种）基因工程酶工程（固定化酶、细胞；环境友好酶制剂；环保用酶制剂）微生物胞外多聚物（表面活性剂、絮凝剂）环境微生物制剂、优势菌种微生物能源（氢气能源）,第一节固定化酶和固定化细胞在环境工程中的应用（酶工程）,生物技术的四大支柱,酶工程：即利用酶、细胞器或细胞具有的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。,酶工程的应用范围,（1）对生物宝库中存在天然酶的开发和生产；（2）自然酶的分离纯化及鉴定技术；（3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）；（4）酶反应器的研制和应用；（5）与其他生物技术领域的交叉和渗透。其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。,酶工程是生物技术的重要组成部分，具有独特之处。酶技术以其高效率、低能耗、反应条件温和等优点在化工、医药、食品工业、轻工业、石油化工产品的生产方面已得到成功应用，环境工程技术方面的应用也将越来越广泛。,酶和酶技术与环保的关系表现在三个层次:,1、在产品加工中用酶来替代化学品可以降低生产活动的污染水平，有利于实现工艺过程生态化或无废生产，真正实现清洁生产的目标。例如纸浆漂白用木聚糖酶、漆酶。2、酶作为添加剂加入到产品中，使产品在使用过程产生的污染大大减少，利于环保。例如饲用植酸酶。3、直接应用酶与酶技术进行污染物的降解和环境监测。例如脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等混合处理生活污水。,早期的酶工程技术主要是从动物、植物、微生物材料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。70年代后，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。,随着第三代酶制剂的诞生，应用各种酶工程技术制造精细化工产品和医药用品及其在化学检测、环境保护等各个领域的有效应用，使酶工程技术的产业化水平在现代生物技术领域中名列前茅，并正在与基因工程、细胞工程和发酵工程融为一体，形成一个具有很大经济效益与社会效益的新型工业门类。,酶工程技术的产业化,1、新型抗生素生产工艺抗生素工业是以青霉素的生产为开端的，迄今已有50多年的历史。70年代开始，出现了一种新的生产工艺酶法半合成。已用酶法生产的产品有头孢霉素I号、号、羟头孢霉素、青霉素等。充分显示了酶法半合成作为抗生素生产工艺的后起之秀具有巨大的竞争力。,2、用酶工程法制备新型甜味剂传统的甜味剂主要是蔗糖与糖精。糖精被禁用后，蔗糖就成了食品甜味剂的主角。1973年，用固定化葡萄糖异构酶从葡萄糖生产高果糖浆获得成功，产量迅速增加，目前已达几百万吨，正在逐步取代蔗糖作为食品与饮料的甜味剂。美国可口可乐公司所用甜昧剂几乎是高果糖浆。最近食用甜味剂又出现了一颗新星天冬氨素。它是低热量、安全，又有一定营养价值的新型甜昧二肽，甜度是蔗糖的l50-200倍，可用酶工程法制备。,一、特异生物催化剂酶,酶的功能特异，威力非凡，生物的生长、发育、繁殖、营养、运动以及发酵、呼吸、光合作用、神经刺激、免疫反应无一不受到酶的催化作用。已知酶的种类约有8000种，它们都是由生物细胞合成的一类特殊蛋白质，细胞的一切活动都离不开酶的“推动”。酶催化活力的高效性和专一性是任何其他催化剂所无法比拟的。正因为体内存在为数众多、魔力非凡的酶，体内的生化反应才能在十分温和的条件下飞快地进行。,二、酶制剂及其剂型,酶制剂是指从生物体中经分离、提纯而得到的具有一定纯度和活力的酶制品。酶制剂的大规模生产主要是利用发酵工程技术。最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取，如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。之后，Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破，其方法至今仍被采用。,第二次世界大战以后，随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善，利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业，并开辟了广阔的市场。,PilotBiostatUD50,以微生物酶为主体的酶制剂工业形成于50年代。其中工业用酶50-60种，治疗和诊断用酶120多种，酶试剂300多种，已涉及到食品、医药、发酵、日用化工、轻纺、制革、水产、木材、造纸、能源、农业、环保等经济部门。因此，人们把酶制剂工业称为工业领域中的“医学金矿”。,新型酶制剂,1、酿造用酶（酒精酿造用酶、啤酒酿造用酶、白酒酿造用酶、葡萄酒酿造用酶）：纤维素酶、半纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶等。2、食品加工用酶：谷氨酰胺转胺酶、高果糖浆生产用酶（葡萄糖异构酶、菊粉酶）、果汁专用酶（果胶酶、淀粉酶、纤维素酶、酸性蛋白酶）。3、制革用酶：蛋白酶。,3、纸浆（造纸）用酶：纸浆漂白用酶（木聚糖酶）、废纸脱墨用酶（木聚糖酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶）、造纸废水处理用酶（脂肪酶、甘露聚糖酶、漆酶、果胶酶）。4、洗涤用酶：碱性蛋白酶、碱性脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶。5、纺织用酶（绿色染整工艺）：果胶酶、纤维素酶、过氧化氢酶。6、饲料用酶：植酸酶、角蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。,1、干燥粗酶制剂：用麸曲或深层发酵的酶培养液除掉菌体（不除掉菌体）后，与淀粉等惰性填料混合、干燥制成的粗酶产品。2、稀液体酶制剂：将酶培养液过滤除去菌体等杂质后，直接加稳定剂（甘油、乙醇、氯化钠等的复合物）和防腐剂制成的产品。国内许多白酒厂用这种液态糖化酶制剂糖化淀粉。,酶制剂剂型,3、浓液体酶制剂：将酶培养液过滤除去菌体等杂质后，浓缩后再加稳定剂和防腐剂制成的产品。4、干燥粉状酶制剂：我国生产的酶制剂多属此类型。其制备工艺为：工艺1：酶培养液除去菌体浓缩喷雾干燥研磨加稳定剂、惰性填料制成产品；工艺2：酶培养液除去菌体硫酸铵盐析或乙醇沉淀干燥研磨加稳定剂、惰性填料制成产品,5、结晶酶：是经过高度纯化而结晶的固体酶制剂。制备过程：在酶溶液中缓慢加入硫酸铵或氯化钠而使溶液呈轻微浑浊，即接近过饱和状态时，静置于低温（0-4）下就能析出结晶酶。不同种类酶的结晶时间不同，几个小时-几周。酶结晶条件：酶蛋白浓度在3-50mg/mL，酶的纯度50%。6、固定化酶：将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可长时间使用。,洗涤剂用酶迅速普及西欧、美、日等国；凝乳酶广泛用于乳酪制造；酶制剂新市场催化剂、医药用酶和三废处理用酶迅速发展；应用固定化异构酶大量生产高果糖浆；筛选耐高温脂肪酶、糖化酶和蛋白酶；应用基因工程技术改造和生产新型酶制剂。,酶制剂的主要发展动态是：,20世纪90年代，随着基因工程的广泛介入，一些原来只能由动物或植物生产的酶，经过酶基因重组，可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制，因此“基因工程发酵工艺先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。,国际上酶制剂的年产量已超过10万吨，其来源有动物、植物与微生物。微生物酶制剂是工业酶制剂的主体，年产值已超过6亿美元。由于酶制剂主要作为催化剂与添加剂使用，它带动了许多产业的发展。,微生物酶的开发,1、应用微生物来开发酶的优点：(1)微生物生长繁殖快，生活周期短。(2)微生物种类繁多，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。(3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。,微生物酶的开发,(4)特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。,微生物酶开发的一般程序（酶的发酵生产）,(一)样品的采集采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。(二)菌种的分离培养基的确定、培养条件的确定。(三)菌种的初筛1、用简单的定性反应进行初筛；2、在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件，进而让目的菌株得以繁殖，尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。,微生物酶开发的一般程序,(四)菌种的复筛初筛之后，还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上，筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。酶活的测定方法的建立尤其重要。,微生物酶开发的一般程序,(五)对复筛获得菌株的要求1、不是致病菌；2、菌株不易变易和退化；3、不易感染噬菌体；4、微生物产酶量高；5、酶的性质符合应用的需要，而且最好是胞外酶；6、产生的酶便于分离和提取，得率高；7、微生物培养营养要求低。,微生物酶开发的一般程序,(六)最佳产酶条件的初步确定1、培养方式的确定；2、最佳培养条件组合；3、微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶)；4、微生物酶收集的时间顺序；,(七)微生物产酶性能的进一步提高1、获得高产菌种的突变体；2、利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量；3、运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应的微生物细胞之内，使其高效表达；,三、酶的分离提取,酶提取的定义：是将酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以供进一步从中分离纯化出所需的酶。通常生物材料中所含酶的总量并不太少，但每一种酶的含量却很低，常在0.0001-1，如胰腺中含有5的胰蛋白酶，而脱氧核糖核酸酶仅含0.004。,由于各种酶在生物材料中含量很低，因此提取、分离和纯化各种酶制剂是一项比较复杂的工艺过程，犹如“沙里淘金”的“冶炼术”。在提取酶之前要进行预处理，不同的酶有不同的预处理方法。,1、胞外酶的预处理和制备酶培养液：将菌体过滤或离心去除，所得的清液即为粗酶液。酶固态发酵麸曲：用水或缓冲液浸泡，再离心或过滤去除菌体及杂质后所得清液即为粗酶液。粗酶液再经提纯即得精酶制品。2、胞内酶的预处理：胞内酶需要破碎细胞壁、质膜，然后制成无细胞提取液，再提纯。细胞破碎的方法：干燥法（空气干燥、真空冷冻干燥、溶剂脱水干燥）、机械法（研磨法、机械捣碎）、超声波破碎、反复冷冻法、自溶法、溶菌酶法。,（一）预处理,机械破碎,捣碎法研磨法匀浆法,物理破碎,温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法,化学破碎,有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween,酶促破碎,自溶法外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。,通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。,通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,JY92-IID超声波细胞粉碎机,细胞破碎珠,高压细胞破碎机,DY89-I型电动玻璃匀浆机,（二）酶的提取,1、水溶液提取法用稀的盐溶液、缓冲液或水提取。（对酶蛋白稳定性好、溶解度大）均匀搅拌、控制好温度（5以下）加入蛋白质水解酶抑制剂：二异丙基氟磷酸、碘乙酸特别注意提取液pH和盐浓度：碱性酶用偏酸性提取液，酸性酶用偏碱性的提取液。大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。在提取液中加入少量氯化钠（0.15mol/L）或其他中性盐。缓冲液常用0.02-0.05mol/L酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。,2、表面活性剂提取法,表面活性剂：天然的胆酸盐、磷脂；人工合成的离子型十二烷基硫（磺）酸钠（SDS、阴离子型）、二乙氨基十六烷基溴（阳离子型），非离子型吐温、三通-X（Triton-X）。,3、有机溶剂（丁醇）提取法,对不溶于水、稀盐溶液、稀碱稀酸，以及和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的酶（脂蛋白），可用乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂（亲水性、亲脂性强）提取。蛋白酶（胞外酶工业提取流程图，书363页）,四、酶的纯化,提取的酶要先浓缩、去杂质后再纯化。（一）浓缩浓缩方法：葡聚糖凝胶-分子筛浓缩法、聚乙二醇（PEG）浓缩法、超滤膜浓缩法、冰冻法、盐析或乙醇沉淀后分离法。（二）去杂质去杂质的方法：pH沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异法、蛋白沉淀剂法。,1、盐析法。采用中性的硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠来纯化酶。2、有机溶剂沉淀法。在酶溶液中缓慢加入相当于酶溶液浓度2倍的有机溶剂（乙醇或丙酮），以降低酶溶液的电解常数，增加酶蛋白分子电荷间的引力，导致酶蛋白的溶解度下降而沉淀。3、层析法。包括吸附层析法、离子交换层析法、分子筛过滤层析（凝胶过滤层析）法、等电点沉淀法。,（三）纯化,酶的纯化,溶解度的差异,盐析法PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法,热稳定性的差异,热处理沉淀法,电荷性质的差异,离子交换层析法电泳法,分子大小和形状的差异,凝胶过滤法超滤法透析法离心法,亲和力的差异,亲和层析法,疏水作用的差异,疏水层析法,分配系数的差异,双水相系统萃取法,（四）结晶,当酶达到一定纯度后，在适当的温度、pH条件下，逐渐加入硫酸铵溶液（或某些有机溶剂），酶可慢慢析出结晶。,酶分离提纯步骤如下：,酶的提取、分离纯化技术路线,细胞破碎,酶提取,酶分离纯化,酶浓缩,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,发酵液,离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。,在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。,五、酶的干燥,六、固定化酶与固定化细胞,固定化酶与固定化细胞是酶工程的核心“软件”，因为以它为基础就可以根据化学反应工程的需要，组装成高效、连续运转的生物反应器，再与其他工程设备、电子元件配套形成完整的生物反应工艺装置。1、固定化酶：又称水不溶酶，是从筛选、培育获得的优良菌种中提取活性高的酶，再用包埋法（或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统等）将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即固定化酶。,（一）固定化酶和固定化微生物,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,什么是固定化酶？,酶的固定化技术和固定化酶,通过物理吸附法或化学键合法将水溶性酶和固态的不溶性载体相结合，使酶变成不溶于水但仍保留催化活性的衍生物。,(1)酶的稳定性差,在温度、pH和无机离子等外界因素的影响下,容易变性失活(2)酶通常在水溶液中与底物反应，反应结束后，即使仍有较高酶活力，也难于回收利用，成本较高，不便连续化生产(3)酶反应后成为杂质与产物混在一起,增加分离纯化的困难,直接应用酶的不足之处:,改善方法之一思路：设计一种方法,将酶束缚于特殊的相,使它与整体分开但仍能进行底物和效应物的分子交换。这种固定化的酶可象一般化学反应中的固体催化剂一样既有酶催化特性,又有一般化学催化剂能回收，反复使用等优点,并可使生产工艺连续化自动化。,(1)固定化酶(2)固定化菌体(死细胞)(3)固定化活细胞(增殖细胞)(4)固定化原生质体(5)固定化动植物细胞,发展历史,1953年,德国,Grubhofer、Schleith,聚氨基苯乙烯树脂为载体，重氮法;1969年，日本，千畑一郎，固定化氨基酰化酶，从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，首次工业规模应用固定化酶，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱离出来;1971年，第一次国际酶工程会议确定固定化酶统一英文名称为ImmobilizedEnzyme。,1973年，日本首次在工业上成功应用固定化大肠杆菌菌体中天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精；1978年，日本用固定化枯草杆菌细胞生产淀粉酶，开始了固定化细胞产酶的先例。1979年，固定化毛地黄细胞和长春花细胞成功；1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸。,优点,(1)提高酶稳定性；(2)可反复或连续使用；(3)易于和反应产物分开；（4）酶反应过程可严格控制；（5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；（6）较游离酶更适合多酶反应；（7）增加产物收率，提高产物质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。,缺点,（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶须分离。,固定化酶制备原则,（1）维持酶的催化活性及专一性；（2）有利于生产自动化、连续化；（3）应有最小的空间位阻；（4）酶与载体必须结合牢固；（5）应有最大稳定性，载体不与废物、产物或反应液发生化学反应；（6）成本要低。,（二）固定化酶和固定化微生物的固定化方法（固定化技术）,微型胶囊法吸附通过双功能试剂进行共价交联胶格包埋和水不溶性载体共价结合,酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）,酶固定化的模式图,A-载体结合法；B-交联法；C1-包埋法（格子型）C2-包埋法（微胶囊型）；D-逆胶束酶反应系统,酶和细胞固定化模式,1、载体结合法以共价结合、离子结合和物理吸附等方法将酶固定在非水溶性载体上的方法。包括共价结合法、离子结合法、物理吸附法、生物特异结合法四种。常用载体：葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝等。,吸附法,用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法;固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用;(2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.,back,物理吸附法-利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。静止法电沉积法反应器上直接吸附法混合浴或振荡浴吸附法,优点：固定化时酶分子的构象很少或基本不发生变化。缺点：结合力弱，易解吸附。常用载体：无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷,离子结合法常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶酶分子含有离子交换基团的固相载体第一个离子结合法固定化酶：DEAECellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-SephadexA-50固定化氨基酰化酶,共价键结合法,可以形成共价键的基团：游离氨基，游离羧基，巯基，咪唑基，酚基，羟基，甲硫基，吲哚基，二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体,5-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5-单核苷酸（本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶）,2、交联法指酶与两个或两个以上官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。交联剂:戊二醛、双重氮联苯胺酶。,双功能试剂：常用的是戊二醛OOHCCH2CH2CH2CH,第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶,图711酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,表72常用于固定化酶的交联剂交联剂参考文献戊二醛1316二重氮联苯胺2，2二磺酸17，184，4二氟3，3二硝基二苯砜19二苯基4，4二硫氰酸2，2二磺酸201，5二氟2，4二硝基苯21酚2，4二磺酰氯223甲氧基二苯基甲烷4，4二异氰酸盐23,3、包埋法将酶包埋在凝胶微小格子（格子型）或由半透性的聚合物膜（微胶囊型）内的固定方法。将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。格子型包埋材料：聚丙烯酰胺、凝胶、琼脂、硅胶等。微胶囊型包埋材料：尼龙、乙基纤维素、硝酸纤维素。,微生物细胞的固定化最适合用凝胶包埋法。,包埋法,将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中的固定化方法多孔载体琼脂、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚酰胺、火棉胶等,(1)凝胶包埋法,天然凝胶条件温和，操作简便，对酶活影响小，强度较差；合成凝胶强度高，耐温度、pH值变化强，因需聚合反应而使部分酶变性失活适用性：不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化,(2)半透膜包埋法,半透膜：聚酰胺膜、火棉膜等，孔径几埃至几十埃，比酶分子直径小适用性：底物和产物都是小分子物质的酶微胶囊：直径一般只有几微米至几百微米?,微型胶囊法,胶格包埋法将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法,首先被采用的胶格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀酰胺引发剂inactiation,4、逆胶束酶反应系统逆胶束指表面活性剂等两性分子在有机溶剂中自发形成的聚集体。其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶反应系统。逆胶束酶法指将酶以逆胶束的形式固定。5、复合法,固定化酶方法的优缺点比较,1、稳定性2、最适温度3、最适pH4、底物特异性,go,固定化酶的性质,1、稳定性,比游离酶的好（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度,A固定化酶,B游离酶,（2）保存稳定性好，保存时间延长（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白（4）对变性剂(如尿素、有机溶剂、盐酸胍等)的耐受性提高，保留较高酶活（5）对酶抑制剂、对不同pH稳定性提高.,2、最适温度,与游离酶差不多,3、最适pH值,酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶pH曲线常发生偏移（见图），原因是微环境表面电荷性质的影响,pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响,4、底物的特异性,与底物分子量的大小有关;作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右原因:载体的空间位阻作用,评价固定化酶的指标：,1酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。计量单位2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位品质的体现,3.固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。4.操作半衰期：衡量稳定性的指标。连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）,固定化酶的研究现状,始于1910年，70年代全球普遍开展研究。已取得很多成果，但多限于简单的胞外酶-水解酶、少数胞内酶。对大分子降解能力强，对小分子无分解能力。多酶体系的固定化尚有待于研究开发。,酶的催化作用主要取决于酶的活性部位(即活性中心)与底物的相互作用。酶的活性中心是由数个氨基酸残基组成的。要使酶在固定化状态仍保持活性不变，使用时活力长久不衰，则必须保持活性小心不受损伤。,制备固定化酶或固定化细胞时，需要在严密和尽量温和的条件下进行，已研究许多有效的方法可以制备表现活力高，使用寿命长的“长效、无公害”的生物催化剂。因为应用这些催化剂不仅使用寿命长，而且整个工艺过程几乎无三废污染。,在固定化酶广泛应用的基础上，人们发现天然细胞本身就具有多功能的系列化反应系统，因此采用物理或化学方法将细胞固定化，这是利用酶或酶系的一条捷径。固定化细胞技术开始于70年代，其实际应用程度已超过固定化酶。,固定化细胞比固定化酶具有明显的优点，主要是省去了破碎细胞提取酶的手续。酶在细胞内环境中稳定性较高，进行完整细胞固定化时，酶活力丢失较少。尤其在需要利用复合酶系时，应用固定化细胞生物反应器可以把发酵工艺改为连续酶法反应，其制造成本也较低。,2、固定化微生物（固定化细胞）,以与固定化酶相同的固定方法将酶活力强的微生物体固定在载体上，即成固定化微生物。微生物体本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持其原有活性，甚至可提高活性。包括死细胞固定化、生长细胞固定化。,固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。通过化学或物理的手段将游离细胞或酶定位于限定的空间区域内,使其保持活性并可反复利用。,固定化细胞的依据,1）从广义上讲，微生物细胞所具酶系统相当于被一层层具有选择透性的胞膜或质膜所包埋，这些酶本身已经是固定化酶。2）既然固定化细胞本身已经是一种固定化酶，如果设法除去细胞所特有的对细胞起自溶作用的酶系统，并防止外来细胞对它的侵袭，就能使此细胞反复利用。,3）细胞膜（包括原生质膜、线粒体膜、核膜等）具有选择透性，往往阻止人们因生产某种产品所加特定底物的进入（不象尼龙），这是细胞固定化过程中需考虑的。4）微生物细胞具有维持其生命活动的完整的酶系统，各酶又严格地处于各亚细胞器上，酶促反应有着严格的顺序性，在制备固定化菌体细胞的过程中应尽可能完整地保持细胞的这种特定状态。,良好固定化细胞方法的条件：,1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度；2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻；3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH值和温度下，不会被破坏；,4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性；5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应；6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。,有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：无须进行酶的分离纯化保持酶的原始状态，酶回收率高比固定化酶稳定性高细胞内酶附助因子可再生细胞本身含多酶体系抗污染能力强,固定化细胞的特点,3、固定化酶和固定化微生物的特性,稳定、降解有机物性能力强，耐毒，抗杂菌，耐冲击负荷。制成酶布和酶柱后用于连续流运行，酶不会流失。,固定化微生物技术的主要特征,密集微生物，维持反应器中的生物量浓度易于实现固液分离适用于含有有毒有害物的处理,六、固定化酶和固定化细胞在环境工程中的应用及前景,固定化微生物技术的发展,固定化酶技术只限于水解酶类和少数胞内酶研制成功和应用，多酶体系的固定化技术尚未解决；废水的组分复杂、经常变化，要用多种单一的固定化酶才能完成某一物质的多步骤反应，才能使有机物完全无机化和稳定化。固定化酶制成酶膜、酶布、酶管（柱）、酶粒、酶片。如废水中的氰化物在氰水解酶、甲酰胺酶、甲酸脱氢酶的作用下，分解为二氧化碳、氢气、氨。,（一）在废水生物处理中的研究现状,处理三废应用固定化酶或固定化细胞可以组成快速、高效、连续运行的污水处理系统。如用固定化分解氰化物的细菌除去废水中的氰化物；用固定化-淀粉酶处理造纸厂的废水；用水解农药的细菌固定化制剂处理农药废水等。,难降解有机废水的处理,含酚废水的处理含芳香族类化合物废水的处理其他难降解废水的处理,高浓度有机废水的处理,通过筛选分离出高效菌株或是通过生物工程技术培养特异菌株并进行扩大培养及固定提高反应速率和处理效率减少污泥量和二沉池的负荷降低基建投资费用,含重金属废水的处理,由于微生物经固定化后,其稳定性增强,抗生物毒性物质的能力大大增强。因此,可被广泛地用于有机废水中重金属离子的去除,污水脱氮除磷,硝化菌、反硝化菌的增殖速度慢,要提高去除率就要求反应器有较长的固体停留时间和较高的细菌浓度,采用固定化微生物技术可做到这点。,德国将9种降解对硫磷农药的酶共价结合固定在多孔玻璃珠、硅胶珠上，制成酶柱处理对硫磷废水，获得95%以上的去除效果，连续工作70天，酶活性没有变化。日本用固定化-淀粉酶处理淀粉废水和造纸废水。存在问题：成本昂贵，使用寿命1-2年，机械强度差，在酶布或酶柱上易长杂菌，这些都是目前亟待解决的问题。,固定化微生物应用研究较多。制备多种混生的固定化微生物对提高处理效果是有益的。我国：始于20世纪80年代，从活性污泥分离、筛选分解能力强的微生物，制成固定化微生物用于废水处理试验（含氰废水、含酚废水、印染废水、洗涤剂废水、淀粉废水、造纸废水等），处理有一定难度。小水量的特种工业废水处理有可能实现。,固定化微生物技术的发展趋势,比普通活性污泥法的处理能力高1-3倍,出水水质好,抗水力、有机负荷的冲击能力强,可降低运行费用与投资对于厌氧消化工艺,可保留对环境干扰敏感、生长缓慢的产甲烷细菌,缩短了起动时间,使工艺稳定地运行在降解有毒污染物方面,抗毒性作用明显加强,需要解决的问题,混合固定技术的进一步研究和开发高效固定化微生物反应器工艺研究开发耐用廉价微生物固定化载体研究开发,根据固定化酶用于化学分析方面的相同原理，固定化酶也可以用于测定有毒物质的含量，进行环境监测，如用固定化多酚氧化酶检测水中的酚类物质；利用固定化酶还可以检测有机磷、有机氯农药和其他痕量的环境污染物(如过氯酸盐、氰化物和尿素等)。,（二）环境监测,（三）固定化微生物在废气生物处理中的应用前景,因废气的组分没有废水的复杂，而且将废气由气相转化为液相所产生的废水量不大，其处理难度相对较小，开展了这方面的可行性试验，有望在生产中应用。废水处理中的生物膜被固定化的混生微生物群体，固定在载体表面，类似于载体结合法，耐毒和耐冲击负荷差些。优点：其培养、固定化（挂膜）的方法简单、成本低，实用性强。,七、固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用,葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。葡萄糖异构酶葡萄糖果糖果葡糖浆,聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类,固定化酶在医药治疗上的应用,例1固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素,新能源开发中的应用,H2是重要的能源物质，虽然有许多微生物可以产生H2，但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌连续产氢，稳定性比天然细胞好。将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶原膜包被，可用于水的光介产生氢气和氧气,八、共固定化技术（联合固定化技术）,1、概念,共固定化（Co-immobilization）-是将酶、细胞器和细胞同时固定于同一载体中，形成共固定化系统。,这种系统稳定，可将几种不同功能的酶、细胞器和微生物细胞进行协同作用；共固定化技术是在混合发酵技术和固定化技术的基础上发展起来的一门新技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。,2、共固定化的形式,1）细胞/细胞,如啤酒酵母与大肠杆菌,2）细胞/酶,如黑曲霉与过氧化氢酶,3）细胞器/酶,如叶绿体与氢化酶,3、共固定化技术的应用,例如：纤维素分解常受其中间产物和末端产物葡萄糖的抑制若将酵母和纤维二糖酶一起共固定化，制得的新型生物反应器既能将纤维二糖转化成葡萄糖，同时还可以将葡萄糖发酵成酒精。这样便可消除纤维二糖水解产物葡萄糖的抑制作用，亦可进行连续发酵生产酒精。,九、环境友好（环保用）的酶制剂,1、木聚糖：是植物细胞壁的主要成分，是最普遍的半纤维原多糖，是最丰富的可再生的半纤维素，是-D-木糖吡喃型单元通过-1，4-键连接起来。木聚糖酶：是一类降解木聚糖的酶系，包括木聚糖内切酶、-D-木糖苷酶、-L-阿拉伯糖呋喃糖苷酶等。,来源：木聚糖酶可由许多微生物产生，同一种微生物往往产生不只一种类型的木聚糖酶，它们的底物结合位点不同。应用：1、食品改良剂；2、饲料添加剂；3、环境保护：4、纸浆漂白助剂（预漂剂）。,纸浆漂白,传统的化学漂白法：是采用多段的氯/二氧化氯漂白及碱提取来去掉木质素，在废水中会有大量含氯的、致癌致畸的物质，造成严重的环境污染和生态破坏。酶法漂白：芬兰率先将生物预漂白技术引入制浆造纸工业中。酶法助漂新工艺已在欧洲和北美的大型纸厂应用，成为生物技术在造纸工业应用最成功的一例。,研究进展,国外：丹麦诺维信公司和美国山道斯化学公司等多家酶制剂厂商，纷纷推出专门用于纸浆处理的木聚糖酶新产品。我国：有关这方面的研究还刚刚起步，至今只是少数几个实验室进行了探索性的研究，但尚未有能够应用于工厂生产的商品化酶制剂问世。,2、漆酶,定义：是含铜糖蛋白酶，能催化多酚、多氨基苯等底物氧化，是单电子氧化还原酶。自然界分布：植物、动物、昆虫、微生物等。漆树漆酶、真菌漆酶。催化的底物：酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素和生物色素、金属有机化合物、其他非酚底物。,应用前景：(1)环境保护：处理工业“三废”、化学农药分解时产生的毒物酚或芳胺；用于染料的脱色。（2）造纸工业：催化木质素的降解，用于造纸工业中纸浆的生产和漂白。（3）纺织工业：诺维信公司的DenilitIIS可以进行牛仔服装仿旧整理工艺，获得的织物手感厚实，表面光洁、平整、色泽明快、淡雅。,3、单加氧酶,定义：是一种氧化还原酶，在该酶的催化下参与反应的O2分子中的O-O键断裂，一个氧原子转移到底物上，参与产物的合成，另一个氧原子则被还原为水。分布：极为广泛，它几乎存在于自然界的一切生物体内，包括人、动物、植物和微生物等。,作用：催化许多内源性底物（如脂肪酸、维生素、前列腺素）的合成与代谢；有效降解多种外源毒性物质。分类：金属蛋白单加氧酶、黄素蛋白单加氧酶。,国内外研究现状：,国外的研究较为广泛菌种、单加氧酶的反应机制探讨、单加氧酶在化工、医药及环保等诸方面的应用；国内仅仅局限于对甲烷单加氧酶的羟基化、环氧化反应的研究，即以甲烷营养菌为产生菌，甲烷和丙烯为底物合成甲醇和环氧丙烷。,单加氧酶的应用：,生物合成：醇类、环氧化物等。生物降解-环境保护：芳香族化合物、氯代烃、杀虫剂。某些细菌中含有一种特殊的甲烷单加氧酶(MMO),具有比较广泛的底物选择性，能够催化降解大多数氯代烃污染物先转化成相应的醇，然后再在其它酶作用下，分解成无害物质。,第二节微生物胞外多聚物的开发与应用,微生物胞外多聚物（Extracellularpolymers，ECP）：是微生物在一定的环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的多聚化合物，包括荚膜、粘液层及其它表面物质。ECP成分：脂、脂肽、多糖脂、中性类脂衍生物。ECP应用：用于石油开采、农业、环境保护、环境工程。ECP用途：用作表面活性剂、絮凝剂或助凝剂、沉淀剂。ECP应用领域：在废水生物处理方面的应用已有报道（石油炼油厂废水、油脂废水的生物处理）；还可应用于破乳、湿润、发泡和抗静电。,一、生物表面活性剂和生物乳化剂的开发与应用,1、生物表面活性剂概述表面活性剂是当今生物技术中常用的和重要的化合物。它可以减少液体、固体和气体界面间的表面或界面张力，使其在水或其他液体中容易混合或扩散因而广泛应用于现代工业的几乎每一个领域。现今世界表面活性剂的年产量已超过300万吨，产值高达约40亿美元。,冰淇淋是我们最喜爱的食物；有了洗涤剂我们的生活才能如此美好。若没有表面活性剂，这两样东西都不会有。这真是太可悲了。但是，如果真的没有了表面活性剂，也不会有人为没有冰淇淋和洗涤剂而哭泣。因为没有表面活性剂，人也没有了。英国著名界面化学家Ckint,来自英文Surfactant。它实际上是短语Surface（表面）Active（活性）Agent（添加剂）的缩合词。它还有一个名字叫做Tenside。,表面活性剂是这样一种物质，它活跃于表面和界面上，具有极高的降低表、界面张力的能力和效率。在一定浓度以上的溶液中形成分子有序组合体，从而具有一系列应用功能。,表面活性剂,定义：表面活性剂是指在加入少量时就能显著降低溶液表面张力并改变体系界面状态的物质。性质：达到一定浓度后可缔合形成胶团，从而具有润湿或抗粘、乳化或破乳、起泡或消泡以及增溶、分散、洗涤、防腐、抗静电等一系列物理化学作用及相应的实际应用，成为一类灵活多样、用途广泛的精细化工产品。,表面活性剂,早在20世纪40年代,Zobell在研究硫酸盐还原细菌从沙粒中释放原油的机制时就指出，微生物产生表面活性剂是细菌驱油的主要机制之一。1957年,捷克的Dostalek和Spumy把脱硫弧菌和假单胞菌同糖蜜一起注入油层，原油产量提高。他们认为,可能是细菌产生的表面活性物质,改变了岩石-油-水三相系统的界面张力所致。,1、概念：生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时，在代谢过程中分泌的具有表面活性的代谢产物。2、独特的属性（与化学合成表面活性剂相比）：结构的多样性、生物可降解性、广泛的生物活性及对环境的温和性等。,生物表面活性剂,生物表面活性剂是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质。与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外,还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点。,生物表面活性剂的分子结构中既有极性基团又有非极性基团,是一类中性两极分子。亲水基团可以是离子或非离子形式的单糖、二糖、多糖、羧基、氨基或肽链;疏水基团则由饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或带羟基的脂肪酸组成。,研究表明:加入微生物或表面活性剂(生物的或化学合成的),能够增强憎水性化合物的亲水性和生物可利用性,使进入环境的污染物不断地降解,该技术称为生物修复其中使用到生物表面活性剂。,目前大多数市售的表面活性剂主要来自石油的化学产品。生物表面活性剂：具有特别高表面活性的生物分子称为生物表面活性剂。它可以来源于微生物、植物以及动物，其中微生物生产的生物表面活性剂是一类具有特别高的表面活性的生物分子，具有较好的两亲性和界面优先分配的能力，而且比较适合于工业化生产。,具有特别高的表面活性和乳化活性；生物可降解性；没有毒性或者毒性低于化学表面活性剂；可在极端的温度和酸碱条件下使用。,生物表面活性剂与合成表面活性剂相比具有以下优势：,2、生物表面活性剂的基本特性,生物表面活性剂由亲水和疏水部分组成，亲水部分由单糖、二糖或多糖、羧酸、氨基酸或肽组成，而疏水部分往往是饱和、不饱和或羟基取代的脂肪酸。对于一些高分子量的表面活性剂分子，如蛋白质多糖络合物，其亲水和疏水部分由不同的分子提供。,特性和功能生物表面活性剂可将发酵液表面张力降低到0.03N/m以下，将正构烷烃的界面张力降低到0.13N/m以下。一些生物表面活性剂也表现出较好的热与化学稳定性。,生理学功能：生物表面活性剂的生理学功能都与生物表面活性剂的两亲性有关。1.可以增强非极性底物的乳化作用和溶解作用，从而促进微生物在非极性底物中的生长。2.抗生性：生物表面活性剂（主要为脂肽和甘油酯）具有杀虫活性。这是由于它具有两亲性，能溶解大多数细胞膜成分而具有抗生素功能。,3、研究进展,国外：已就多种生物表面活性剂及其生产工艺申请了专利，如乙酸钙不动杆菌生产的一种胞外生物乳化剂已经有了成品出售。国内：对生物表面活性剂的研制和开发应用起步较晚，但近年来也给予了高度重视，其中研究最多的就是生物表面活性剂在提高石油采收率以及生物修复中的应用。,4、生物表面活性剂的种类及其产生菌,种类：依据其生化性质和生产菌的不同分为五种类型：糖脂、磷脂和脂肪酸、脂肽和脂蛋白、聚合物和特殊表面活性剂。,微生物生产的生物表面活性剂的类型主要取决于所采用的微生物。从化学类型可分为：（1）糖脂和分枝菌酸脂分枝菌酸脂海藻糖脂鼠李糖脂槐糖脂,（2）肽和聚合物益沐神（Emulsan)：由乙酸钙不动杆菌产生莎梵婷（Surfactin)：由枯草芽孢杆菌生产（3）脂肪酸（4）磷脂,产生菌：是细菌、酵母菌和真菌的代谢产物，大多是从油类污染的湖泊、土壤或海洋中筛选得到的。,5、生物表面活性剂的生产,生物合成概论生物表面活性剂的生物合成途径多种多样，有从头合成疏水部分、亲水部分或者两者都合成，对于那些非从头合成的组分通过改良碳源如糖类、烷烃等来生产，各种不同碳源基质常常能被结合进生物表面活性剂，形成一属有关的分子。,在脂肽中，脂和肽部分都由烷烃直接合成。糖脂如海藻糖脂是一个典型的化合物，其亲水部分（海藻二糖）不受碳基质的影响，而脂肪酸部分则取决于进料烷烃的链长。以烃类为基质生产的生物表面活性剂是生物表面活性剂中的一大类，许多微生物都可以以烃类为单一碳源生长。酵母菌和真菌主要利用直链饱和烃，细菌则除了降解异构烃或环烷烃以外，还利用不饱和烃和芳香族化合物。,微生物降解烃类存在的主要问题是烃的憎水性。各种微生物以不同方式解决这一问题。细菌和酵母菌通过分泌离子型表面活性剂，使培养基中的烃基质乳化。另一些微生物则产生非离子表面活性剂。总之，在烃基质培养时，各种微生物都产生有利于烃基质被动扩散而进入细胞内的效应，这是通过由微生物产生的一大类物质起作用。这类物质也就是所谓的“生物表面活性剂”。,生物表面活性剂的生产,生产生物表面活性剂的微生物可分为三类：完全以烷烃为碳源生产表面活性剂，如Arthrobactersp;仅以水溶性底物为碳源，如Bacillussp;以烷烃和水溶性底物为碳源，如Pseudomonassp。与其他微生物发酵一样，生物表面活性剂生产的目的是获得最大的产率、转化率和最终浓度。另外，减少其他代谢产物的积累十分重要，因为它们会影响产品的物理性质和提取过程。,培养基,1.碳源是影响生物表面活性剂结构和产量的关键。加入烷烃对生物表面活性剂的生产既可能起诱导作用，也可能起阻碍作用。生物表面活性剂前体物质（蔗糖）的加入可以形成甘油脂亲水支链的组成部分，同样脂肪酸部分的