微生物快速检测技术的发展现状ppt课件

.,1,微生物快速检测技术的发展现状,华粤行仪器有限公司邹黎明,华粤行仪器有限公司,.,2,华粤行仪器有限公司,.,3,.,4,企业为什么需要微生物快速检测？,市场销售环节要求快速出货。尤其是一些保质期较短的产品。减少物流的压力，尽可能减少仓存，加快资金周转。节约人力资源成本（外资企业尤其突出）对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快速检测方法尤其重要。可以快速检测原料及半成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物超标情况。,.,5,快速方法势在必行,国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的一大方向。,.,6,华粤行仪器有限公司,.,7,螺旋平板法,DWS螺旋平板接种仪,aColyte自动菌落计数仪,.,8,螺旋平板原理,平皿旋转,接种针往外移动同时自动将样品稀释1000倍,.,9,螺旋平板法的优缺点,优点：与传统方法相比，无需稀释3个梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。缺点：检测时间并没有缩短，菌落总数仍需要培养48小时。需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。,.,10,滤膜法,滤膜法常用于可过滤样品的微生物检测。优点：灵敏度增大，菌落无扩散情况，便于计数。缺点：需要额外的支出购买真空泵，多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒，澄清果汁，桶装饮用水等。,.,11,皿膜法以纸片法为代表,纸片法是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群采用的就是纸片法。优点：无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。缺点：不能节省检测时间。检测成本相对偏高。大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。,.,12,.,13,常规微生物快速检测技术现状,快速检测微生物数量的新方法：1、ATP法：目前产品较多，如CHARM，Biotrace,.等。2、电化学法：Sy-Lab公司Bactrac4300，Tempo,3、颜色变化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的MicroFoss。4、流式细胞技术及激光扫描技术5、其它：热量法，放射测量法,华粤行仪器有限公司,.,14,表面洁净的检测方法,微生物学法：纸片、琼脂板、棉签拭子、海绵拭子非微生物学法（快速法）：ATP(三磷酸腺苷，蛋白质,降解糖、NADP(辅酶II)，其它。,.,15,ATP-三磷酸腺苷,ATP来源于,细菌酵母霉菌生物膜组织残留,废弃物污染人的污染,.,16,.,17,.,18,ATP法两大用途,1、用于食品、化妆品和药品企业对生产线和管道进行快速清洁程度检测。政府检测机构用ATP方法缺乏法律依据。ATP法与微生物数量没有必然的联系。2、改良后用于食品、化妆品的商业无菌检测或终产品检验。,.,19,LUMT清洁程度快速检测,PocketSwabPlus,30秒获得结果,取样,混合,检测,.,21,LUM-T的独特优势,CHEF熟肉制品成熟度检验MicroQ水中微生物污染程度检测Cidelite杀虫剂残留初筛Paslite牛奶巴氏消毒效果Somalite体细胞计数SL/MRLtest抗生素残留检测（连接ROSAimager),.,22,基于ATP原理的用于成品检测的微生物检测系统,CharmLUM-96（用于UHT产品）BiotraceCelsis（主要用于化妆品）Millipore公司的MicroScan,.,23,Celsis和LUM-96,保温2天，检测30分钟（96个样）,.,24,ATP法检测成品的优缺点,优点：LUM-96通常用于进行商业无菌检测。可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。缺点：ATP方法需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，客户通常怀疑假阴性的可能，特别是用ATP单个检测代替常规微生物和致病微生物检测，其风险是一定存在的。(如保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量，取样量太小，由于培养基原因，目标致病菌未大量增菌等原因),.,25,Millipore公司最新推出的MicroStar,.,26,MicroStar的原理及局限性,MicroStar快速微生物检测系统是结合了生物荧光、膜过滤及CCD荧光照相检测等技术的新型检测系统.可过滤样品经膜过滤后，将菌截留在特殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增菌后取出，加ATP释放剂，然后加荧光素和荧光素酶，显示的荧光信号在荧光显微镜或荧光检测器下观察并计数。,.,27,MicroStar的优缺点,优点：缩短培养时间，提高灵敏度。适合于菌数较低的可过滤产品使用。缺点：仪器较昂贵，运行成本也非常贵。不能用于检测未知的可能菌数较高的样品(不知稀释多少倍，因菌数必须稀释至80个左右)。整个检测时间还不够快，通常需16小时以上。,.,28,电化学方法(电导率法或电阻抗法),奥地利Sylab公司的Bactrac4300和Biotrac4200梅里埃公司的Bactometer和Tempo英国Multhus公司(已倒闭)英国DWS公司的Rabit,.,29,外观比较,Bactrac4300,梅里埃的BactoMeter,DWS公司的Rabit,马色斯120,.,30,世界上最好的电化学微生物快速检测产品Bactrac4300系统,Sy-labBactrac4300常规微生物项目快速检测技术,.,31,MicroFoss(Biosys)微生物自动监测仪,微生物生长导致培养基pH值发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化，记录达到突变点的时间。,.,32,Microfoss的特点,与阻抗法类似，可以实现快速检测。缺点：需要购买原厂的预装培养基，应用范围受限制，成本高昂。因此在我国目前还没有用户。,.,33,梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪,基于微生物生成产生CO2的原理。CO2积累越多，底部的CO2传感器变黄，由LED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度。光强度与微生物数量有一定关系。,方法较新，用户还需要一个过程了解。,.,34,FOSS公司BactoScanFC牛奶中总菌数快速检测仪,采用流式细胞原理。对微生物进行核酸染色，用流式细胞技术进行计数,.,35,BactoScanFC的优缺点,优点：速度快(50-150样品/小时)缺点：死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养。灵敏度不够高。适合牛奶企业检测原奶中细菌总数。,.,36,美国Chemunex公司微生物快速检测系统,美国Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相结合，推出的最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。其最大的特点是只检测活细胞数，速度极快，处理量大。与FOSS的BactoScanFC检测死活细胞都检测不同。是目前国际上正在认可的生物荧光定量检测微生物数量的两种方法之一。另一种是Millipore的一款叫MicroStar的基于ATP检测的产品。,华粤行仪器有限公司,.,37,荧光酶标记原理,华粤行仪器有限公司,直接单细胞标记(包括孢子)细胞无增菌要求标记在90分钟内完成直接对活细胞和酵母进行标记,.,38,标记的细菌,.,39,标记后的酵母,.,40,标记后的霉菌,.,41,ChemScanRDI,华粤行仪器有限公司,.,42,三个简单的步骤,2.标记,3.激光扫描,1.过滤,.,43,检测步骤-TVC,1.过滤,2.标记,3.激光扫描,样品过滤,预标记60min,滤膜转移,ChemScanRDI仪器分析,标记30min,.,44,ChemScanRDI主机,激光扫描分析仪3分钟分析时间结果直接显示细胞个数,.,45,Laserscanning,.,46,MicroscopeConfirmation,.,47,ClientPortfolio-Pharmaceutical,-USA-USA-USA-USA-USA-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-EUROPE-JAPAN-JAPAN-JAPAN-JAPAN,JOHNSON&JOHNSON(M)MERCK(M)BAUSCH&LombALCONLONZAWYETHNOVARTIS(M)ASTRAZENECAPARKEDAVISPFIZERINSTITUTPASTEURAVENTISROCHE(M)SANOFI(M)SMITH&NEPHEWGLAXOSMITHKLINE(M)SERONODAIICHITORIIFUJISAWACHUGAI,(M)=multi-siteinstallation,140ChemScansystemsinstalled,DRINKINGWATERAGBARAnglianWater,Ondeo,ThamesWater,Vivendi,Dordmund,Tokyo,SEMICONDUCTORSIBM,Siemens,TI,.,48,流式细胞计数技术,用于非过滤产品,流式细胞:线性流体单细胞分析灵敏的检测头,.,49,Bactiflow,适合实验室或研究用日处理量不大于40个样品,华粤行仪器有限公司,.,50,DCount,适合实验室或生产现场使用日处理量大于40个样品的场合,华粤行仪器有限公司,.,51,标记和检测原理,Enzyme,Viabilitysubstrate,Freefluorochrome,Micro-organism,Detector,Detector,Laser,FlowCell,细胞标记12minutes,细胞计数1minute,.,52,自动吸样无需预处理每批可做64个样，含阴性和阳性质控,最小的人力要求,全自动标记和过滤加所有要求的标记试剂控制温育时间和温度去除大的颗粒(25m尼龙网过滤),快速敏感的分析每小时50个样品直接按个/mL显示结果,.,53,数据处理,区分微生物和颗粒的功能强大产品应用范围广增强灵敏度直接显示细胞数无需数据解释直观易读完整的数据追溯性易于确证,.,54,三种型号的差异,华粤行仪器有限公司,.,55,哪些类型客户可以使用？,大型食品、化妆品、药品企业，对快速检测速度及样品处理量要求高。目前仪器非常贵，运作成本与免疫法相似。,华粤行仪器有限公司,.,56,致病菌快速检测方法,显色培养基法：技术成熟，产品很多。免疫学方法：产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有EIA，ELISA，GLISA，荧光酶免、免疫磁分离等方法。市场上的产品多，如BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix等。分子生物学方法：以基因探针检测法和PCR法为主。基因芯片：研究热点。,华粤行仪器有限公司,.,57,致病微生物快速检测产品,免疫磁分离法Matrix公司的Pathatrix致病菌快速检测系统,ELISA方法澳洲TECRA公司的免疫捕获快速检测,华粤行仪器有限公司,分子生物学方法(基因探针及PCR方法),GLISA-胶体金免疫层析致病菌快速检测条,荧光酶免Vidas系列产品(略),显色培养基法国AES公司,.,58,GLISA胶体金免疫层析检测条,氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。关键是制备单克隆抗体，然后与胶体金交联，在亲水纸层析条上固定。胶体金微生物检测条在国内已经有不少产品，但用户并不多，主要是质量不稳定。外来的胶体金微生物检测产品比较多。,.,59,常见的胶体金检测条举例,大肠杆菌O157,李斯特氏菌,沙门氏菌,.,60,胶体金检测条的优缺点,胶体金检测方法属于免疫检测法，检测的是死菌和活菌。一般需要增菌过夜。增菌后的检测非常简单，约10分钟一般能完成。无需专门的检测仪器。进口的检测条的价格比较高，通常要3090元。,.,61,分子生物学方法,基因探针法及PCR方法在国外已经有相当成熟的表现。有普通PCR，荧光PCR，实时荧光PCR（定量PCR）等多种方法。基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。PCR方法一般不需增菌太长时间，通过PCR方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光PCR技术判断结果。,.,62,分子生物学方法应用前景,试剂盒开发相对比较容易。只要找出特征的基因片断，合成出引物即可