ARMS技术介绍解析PPT课件

-,1,ARMS技术的介绍（theamplificationrefractorymutationsystem）,-,2,一、ARMS技术的原理二、ARMS技术的特点三、MGB探针及原理四、MGB探针的特点五、ARMS技术的应用六、ARMS实例：-地中海贫血位点,主要内容,-,3,一、ARMS技术的原理,基本原理：TaqDNA聚合酶缺少3-5外切酶活性。在一定条件下PCR引物3末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。,突变阻滞扩增系统（ARMS-PCR(amplificationrefractorymutationsystem)），又名等位基因特异PCR(allelespecificPCR，ASPCR)。,-,4,ARMS技术针对引物3端进行等位基因特异性的区分。两种引物形式：“normal”野生型引物，扩增时会被突变的模板阻滞；“mutant”突变型引物，扩增时会被野生型模板阻滞。,-,5,一般情况下，通过引物3端单个碱基的突变来区分等位基因效果并不理想。所以ARMS技术在大多数情况下还会人为的增加引物3端附近的碱基的突变以达到区分等位基因的效果。,N-6,N-4,N-2,N,N-3,-,6,以kappacasein基因的一个突变位点为例,-,7,二、ARMS技术的特点,2.1ARMS技术具有高特异性。,由于ARMS所用的引物是从一段序列在3末端及其附近人为的加入错配的突变位点的一套引物组合中，通过筛选出来的能够区分单个位点等位基因的引物，就保证了其高度的特异性:,-,8,2.2ARMS技术具有高灵敏性检测限可以达到100copies/mL，对于肿瘤组织检测限可以达到0.5%的突变率。,-,9,以BRAFV600E为例,ARMS,直接测序,-,10,2.3检测时耗短，成本低，结果直观好判读ARMS结合QPCR或者电泳技术，均只需进行一次PCR反应，时耗短。ARMS技术需要优化的仅仅是上游引物，这相对于使用MGB探针的荧光定量PCR技术来说，成本低而且结果直观好判读。,-,11,三、TaqmanMGB探针及其原理,TaqmanMGB（Taqmanminorgroovebinder）探针由普通taqman探针和MGB基团两部分组成。,-,12,Taqman-MGBRT-PCR原理,-,13,4.1MGB探针的高Tm值,由于MBG基团对DNA双链小沟具有高的亲和性，因此在PCR反应中，MGB探针相较于普通探针Tm值要高很多，通常要高出10-20。,四、MGB探针的特点,-,14,4.2MGB探针的特异性和灵敏性,MGB探针具有高的Tm值，可以很好的克服GC含量较低的模板的在探针设计时的困难，等位点突变序列间的Tm值相差很大，提高了检测的特异性。,-,15,同时，MGB探针包括一个不发荧光的猝灭基团（NFQ），它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提供检测灵敏性。检测下限可达到50copies。,-,16,4.3MGB探针结果判读,定量实验：一对引物，一条MGB探针。一般用于目标位点的定量分析。,-,17,定性实验：一对引物，一对探针。一般用于等位基因突变位点的分型。主要使用等位点分型点阵来分析。,-,18,ARMS和MGB探针的比较,-,19,五、ARMS技术的应用,5.1ARMS技术结合电泳和QPCR技术。目前采用电泳分析仍是主流，结合QPCR的还较少。,毛细管电泳,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,-,20,目前国内用ARMS技术拿证的试剂盒有三个：1、产品名称：人KRAS基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法)注册号：国食药监械(准)字2013第3400363号生产单位：苏州工业园区为真生物医药科技有限公司2、产品名称：人EGFR基因突变检测试剂盒(Taqman-ARMS法)注册号：国食药监械(准)字2013第3400362号生产单位：苏州工业园区为真生物医药科技有