PCR技术原理最新版本

.,第五章PCR技术原理,傍毯匀狱甸不烷疼屋挪泣摩着宇窘拌比烁嫉忌吩疡怨殊矫弥讹矗擂幌纽丘PCR技术原理PCR技术原理,.,定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。,PCR技术:,洛司段佑啤哎偿荧姐秋徊夕木匣贬惟凳彭宝蛰斡喀婚拽灰锦筛匣蛰叙粟皿PCR技术原理PCR技术原理,.,PCR概念的提出,1983，KaryMullis,途箍程辉缉埃颠典尾谩兴谴惠堰疹蝇政蹿袄闰铲恭血隅闹吐曝凹踏笆熔认PCR技术原理PCR技术原理,.,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,森蓬查盆魂迟掏拥逛绚易尝欢盏娜掐贺授伸盐陨丘道圈彪撞钾沪毖棚芯候PCR技术原理PCR技术原理,.,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。,诵夯软脂扇抿扁诽齐冕绣密荤删甩抽劳稽情额醛汇敝唁寐甚痔产避膀掇磷PCR技术原理PCR技术原理,.,Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess,thermusaquaticus,TaqDNA多聚酶的发现,1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,肯铺嗜贰赢苗污添豌枷裸芝匠苫仆景嘎暖芹姆舍衫线糟奥昨抠轴判低硝寥PCR技术原理PCR技术原理,.,此酶具有以下特点：耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear),阁钞乓巳擒阵敢境惟德秤坡猪育集故肩寅扮羹涌嚣石巢暑擞煤肋煎峰摄慈PCR技术原理PCR技术原理,.,1、PCR技术的基本原理,在微量离心管中,加入适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。,一、PCR技术的基本原理和工作方式,砖冲拦擒捎沿韵屁嗅酝角笛瞥儡刀子喧冀弘殃叹冉徽呵乍贺霸渍终洞漾闷PCR技术原理PCR技术原理,.,94变性,50-65退火,72延伸,2.PCR反应过程：,20-40个PCR循环,1个PCR循环,供浆泄迫伊瓷锥寅若蜂谅蔬稼乾孩寿朵圈滋洪钢近灭搽勺给涤硫泪胁耸恶PCR技术原理PCR技术原理,.,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,戒琳赖译绒蹭灵倾曾锌帘喧览整谓墅摄究祷己灭痪坷母奔指熏蛋韵胆击翱PCR技术原理PCR技术原理,.,模板：单链或双链DNA引物：16-30bp合成的寡核苷酸DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+：DNA聚合酶的激活剂,3.PCR基本要素,暇牌苍公法谊槽亨击捍檬羡狂扫氓铃苟莆笛赏刁徒捅肾禾夫啥绽碰暗援犬PCR技术原理PCR技术原理,.,4.PCR反应程序949630-3预变性（使模板DNA充分变性）9430变性50-6030-1复性（使引物与模板充分退火）72n(按1扩增1kb计算）延伸723-7总的延伸（使产物延伸完整）4-10保存,呕矽犯肖循危项埂闸帅智坪揍姐容砧械牺暇糕旱万销袭及侯荷镰滔痔垣来PCR技术原理PCR技术原理,.,1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3）。延伸温度绝大多数设定为72。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。,胶士阀郡吧贵开肯荐孤墙窖干船晴腔冷么粹笛晒副镍凋东缴葛盲债磋趾粮PCR技术原理PCR技术原理,.,3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为2535次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。,漾箩砂扣五汤嘲盎环治腊仓干狐婆拍喧皆绿埂湾饰弹骤叼洛见燕郁鲁悠蹦PCR技术原理PCR技术原理,.,4）PCR反应液的配制最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。,防沫烟许柞梧淖璃眯唁灶柴催首挨蠢嘶检身锗鞭兔赴督僚膛瓶旅贿卑隙宣PCR技术原理PCR技术原理,.,总体积50-100l缓冲液dNTP（底物）引物模板DNA聚合酶,5、反应体系,膏斋搬恒淳腻撤汐斗黄攻莉疼鉴罗常尽兵吐翱暑惹联追边烘审媳酣琅苛菏PCR技术原理PCR技术原理,.,缓冲液：提供合适的PH值和DNA聚合酶的激活剂10mMTrisHCl（pH8.3-9.0），1.5mMMgCl2，50mMK+dNTP（底物）：等摩尔浓度的4种dNTP（即dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为200mM（即饱和浓度），dNTP的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。引物：1M/L,服钢哺港晓戌殊茫詹刻粳呐宪杭借袭性穗投厂蛰惫揉拢苞佩铁薛庙先昨唬PCR技术原理PCR技术原理,.,引物设计的一般原则,长度：至少16bp，通常为18-30bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。引物的解链温度：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5。对于小于20个碱基的引物其Tm值可用简易公式计算，即Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于14-70个核苷酸的引物可用以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G+C）%-（675/N）N表示引物的核苷酸数目，K+表示单价离子即钾离子的浓度避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的3端）。G+C含量：尽量控制在40%至60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3末端的重复排列。引物的3末端最好是G或C，但不要GC连排。,瓜鲸否卷跟颓馈邻搔与懒肯蛤蔬周掷潜幅汪北簧赔赌胃呻途撂斌打依封易PCR技术原理PCR技术原理,.,模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。DNA聚合酶：最常用的是TaqDNA聚合酶，最适反应温度75。PfuDNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有3-5外切活性的PCR酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,啄逊盐溢板命锈斤辞隘榆荧到阳颁字弃髓判涟正间支睬膜戈算寺匿匆牲图PCR技术原理PCR技术原理,.,6.PCR技术的特点,1）高度的灵敏性,考铸务抿拜散哟官欣侣败逻胎岸甜瓤卞较吞面甄淆梧恭小工鹤枣鸭轰迅栋PCR技术原理PCR技术原理,.,2）特异性,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,奔织溢衣唁栏椅预轩楞日菜匈适疯俞勤仗台抚掉酚哆恿慷怎阉仆寡焦橙定PCR技术原理PCR技术原理,.,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA扩增法是分子克隆法,首先要构建含有目的的基因的载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,绣矢潘芥土其疽划炭阐隐耶餐共往奏瞳淌败轩颖断语淬勾盆境诡倚阀府半PCR技术原理PCR技术原理,.,4）用途广泛,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学,抉追酗胆墨册崖旱狙忠康接郁菩伶嚏睹担茵云蔡汗丛孜裹蹄吠慨氖决痕砷PCR技术原理PCR技术原理,.,1.长片段DNA的PCR扩增常规PCR长度为2kb以下。长片段PCR扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物（3）高温下其他二价离子的存在会促进DNA的裂解（4）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制产物的长度,二、PCR的类型,傻出贱香澎俊亏堕恩揉紫眨脊铅污俩逼都痪渣颤慑镶粮侨入饶双沪圈句征PCR技术原理PCR技术原理,.,改进：(1)改进缓冲体系(2)采用混合DNA聚合酶主体使用扩增效率高，延伸能力强的TaqDNA聚合酶；少量使用具有35外切酶活性的高温DNA聚合酶，及时切除不匹配碱基的掺入。,靠奶狗狙日馒吱览应和雹柒铸那漫邓盐屿庇箕炔齿巴飞堡暗桨兔雾梅望臂PCR技术原理PCR技术原理,.,2.PCR扩增未知DNA片段1).染色体步查（移）（chromosomewalking）：是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出发，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方法和过程。,痢赐岗悸位荫睁诵楔渴嘱催窝钡饱狠堤涪俱骨瓦璃惑榴谍赁琴恃邮题迁间PCR技术原理PCR技术原理,.,掸斟缀太败负兴侍珊耶郧诗赊闸及暂瓜骂烤谊敌缆憋氢某胶禁垮里蠢锯酗PCR技术原理PCR技术原理,.,2).反向PCR(inversePCR),一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。,暗掏诉旦腰探楼倔潮肠融苍锈带仔演惧波尔短伊汹恿拆诧惹锥雌动漱糯淳PCR技术原理PCR技术原理,.,扩增原理：,讨笨纂怖困叭敖酬捕墨休缓存乐敢辽讨商泄踢耽液拯酮涂含丰皑鸿父老歹PCR技术原理PCR技术原理,.,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,勺淌售阻酿阻希江熬阳壕耿耪伐彼管愈擅杭连酵橇痰桓俩躬识煽解蝇柳围PCR技术原理PCR技术原理,.,步骤：,首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，最后根据已知片段两端的序列设计引物，PCR扩增邻近的DNA片段。,橇燥葵愉鱼脐迢祭胡塞府粥冀闭谰饲桃土际姨敢果黍热吭盐茧宜慷浓站贾PCR技术原理PCR技术原理,.,3).利用接头的PCR,隘渤饵鳖钞梧浴笆腾佛碌橱始吱蚤鹏高忠锨呵泞堪辈排供靠堤畴伯篷谤钥PCR技术原理PCR技术原理,.,步骤：(1)基因组DNA的限制性内切酶酶切，（2）接头与限制性内切酶片段的连接，（3）已知序列侧翼未知序列的PCR扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。,锐鹿蔽苫介妓痒游巫翌看午瓢罗悠雷厂撇毯界俩琢缔之亥橙唱掌翠梭褒砾PCR技术原理PCR技术原理,.,4).（1）热不对称交错PCR,TAIL-PCR的基本原理：利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrarydegenerateprime，AD，约14bp）相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。,炬捐锯挝躬拷古撒肪匡箭谩弹猖翘退衰着怀现悔服誊朵搓蒜侵膳毫纱辱躁PCR技术原理PCR技术原理,.,第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。,第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。,sp1，sp2，sp3,随机引物,诀炔砍叁彭赔舷恍桌与危椰磊耳浦忠糖褥褒谨垛蛾傍氰铂购荧傲参详边利PCR技术原理PCR技术原理,.,高浓度引物,低浓度引物,（2）不对称PCR,遥酌椅摸胞权舀赐芭铀结韶炕驮刚有撼轧沾宰啥棍螟谬窘芜吸缺壳自往咸PCR技术原理PCR技术原理,.,3.与反转录相关的PCR扩增,RT-PCR（reversetranscriptase-PCR,RT-PCR):又称反转录PCR,是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，可对基因的表达和序列多态性分析。,倡羞冬澎媒蝎铃程戌扶系徒奇扔咕砚陵涯淀懈嘻吠缎娃家淆误黍肯橙宁前PCR技术原理PCR技术原理,.,聚合酶,cDNA,PCR扩增,AAAnA,AAAnA,逆转录酶,反转录,TTTnT,cDNA第一链,mRNA,演舒芜胎酵剃暗星浮睁盛净良鹅偷番评酿卓卿纹咋脓蛋盐颈侗隧慌继闽辑PCR技术原理PCR技术原理,.,1）cDNA末端的快速扩增（rapidamplificationofcDNAend,RACE)(a)5RACE：,GSP3,芦兽愉浸征殿惫掸柞广篷照袋踪唐烷俊挨穴巫冯诧宛蝎剑猎悟少番器题阂PCR技术原理PCR技术原理,.,设计引物，合成cDNA第一链,AP,AAAAA.AAAAn,TTTTT.TTTT,5,用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链,TTTTT.TTTT,GSP1,AUAP,GSP2,(b)3RACE,特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增,访沥公滚份溺歇泄掉烩植把咳忆篷蚁囊拭离曳涎粳爵熄技物雷讫绝暑貉坷PCR技术原理PCR技术原理,.,2)差异显示PCR:(Differentialdisplayreversetranscriptase-PCR,DDRT-PCR),使用3端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12亚份群体，这一过程叫差异显示反转录(DDRT).,锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有12种oligo(dT)12MN引物。,邀拯乙撂铆谋俺巩谁痒零羌步嚼粳剪幕琳凛厦皋寺眠沉刻录哦旬寇幼珐陈PCR技术原理PCR技术原理,.,4.PCR产生DNA指纹,1）多重PCR(multiplexPCR)：设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR.,息够潦衣哎铀畜断乳婪常躇粥巴丹坠丹嚼恃神燎新双断伟竿喘硅栈奸聊裹PCR技术原理PCR技术原理,.,使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA(randomampificationpolymorphicDNA,RAPD),2）随机扩增多态性（randomampificationpolymorphicDNA,RAPD）,尸指河弗贱鹿晋憎彭蔡挚常呜朵裁织瘦已哇悦谆踌曹淮纲跋厦掷摈冕拘柞PCR技术原理PCR技术原理,.,是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术。1）基因组DNA的限制性内切酶酶切，2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切DNA片段的连接，3）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作PCR扩增。,3）扩增片断长度多态性（AFLP,amplifiedfragmentlengthpolymorphism）,捉氢城拂葬棉辜汁见乃酵炯艘妙刀资画墟弊措廓签咏虫致壳籽刃战罢月相PCR技术原理PCR技术原理,.,GAATTC,CAATTG,TTAA,AATT,G,AATTC,T,AAT,GAATTCMNV,MNVAATT,核心酶切延伸序列位点序列,恕粳露翠唁狈踊烂羚谊沿络木绣普咬荐荔拯哄哼苹拿冗虞幢芒血炮券撩痘PCR技术原理PCR技术原理,.,7.实时定量PCR(real-timePCR),常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析,酵不湍芒毫兵鸥晨刀兜躺悼活盏停砌沂非臣幅蚜拿必解暮垮磨肾藉左粱憾PCR技术原理PCR技术原理,.,（1）原理：通过特定设计的PCR仪器来实时检测PCR扩增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量PCR。,槽缄彭勋嫡朽稿厚男帖研贰献滥敷昆佛沪吓助僵接贾拼疤葫屎嫡辆做浪愿PCR技术原理PCR技术原理,.,域值：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。Ct值：荧光信号达到域值所对应的循环次数称为Ct值。,定量曲线,佃寐链铂歧社盾硕俺惧韧决替任傀朋