《糖的组织化学》PPT课件.ppt

组织化学histochemistry特殊染色,通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂,定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分,同时又能保存原有的形态改变,达到形态与代谢的结合.可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸、某些金属元素等。,糖的组织化学,糖的分类,单糖和双糖多糖：淀粉、纤维素、糖原粘液物质（粘多糖）中性粘多糖酸性粘多糖糖蛋白粘蛋白氨基己糖4%糖蛋白氨基己糖4%5.糖脂含有半乳糖,脂肪酸,神经氨基醇,糖原,一.糖原的概念,由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内的多糖分布：胞浆内肝、心肌、骨骼肌同种葡萄糖的聚合物作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片,二.固定剂的选用,Carnoy（冷4）无水乙醇60ml防止糖原溶于水氯仿30ml增加渗透力冰醋酸10ml抵消乙醇对组织的收缩、硬脆作用*优点：固定迅速，保存肝糖原,2.Gendre（冷4）苦味酸无水乙醇饱和液80ml甲醛15ml冰醋酸5ml临用前混合配制,3.Lillie固定液（AAF）无水乙醇85ml冰醋酸5ml甲醛10ml固定液预冷4，固定24h后，95%乙醇脱水，包埋,三.固定中注意事项,1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液2.应用含酒精的溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质膜保护起来，,四.显示糖原的方法,1.碘染色2.胭脂红染色*3.过碘酸-Schiff反应4.银浸染法,过碘酸-Schiff反应,Periodicacid-Schiff,PAS,(一）染色原理,过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上的羟基（-OH）变为醛基（-COOH）,Schiff氏试剂是付品红（碱性品红）经SO2作用后，形成的无色溶液,付品红,Schiff试剂,当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀,*PAS反应的基本原理1.通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基2.醛基与Schiff试剂反应显出红色沉淀,(二)染色步骤,1.切片脱蜡至水2.1%过碘酸溶液内氧化5-10min3.流水洗5min,再用蒸馏水洗4.用Schiff试剂处理10-20min5.流水洗10min6.复染(可用Mayer明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核)7.脱水、透明、封片,切片经二甲苯和各级酒精复水后，入0.5%的过碘酸溶液中作用15分钟，取出后水洗。,切片充分洗净后入Schiffs试剂中进行显色。作用15分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。,肝糖原-PAS染色X200,肝糖原-PAS+苏木素复染X200,【结果】胞浆内PAS阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色红色深浅反应含糖原量的多少【对照】采用淀粉酶或唾液酶消化切片对照片PAS（-），未处理片（+）,ThisnormalglomerulusisstainedwithPAStohighlightbasementmembranes.Thecapillaryloopsoftheglomerulusarewell-definedandthin.,A888kidney11-PAS,A888kidney14-PAS,（三）PAS反应的应用,证明与鉴别细胞内空泡样变性（水变性、脂肪变性、糖原）心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究糖原累积病的诊断及研究糖尿病的诊断及研究某些肿瘤的诊断与鉴别,肝细胞水变性,肝脂肪变性(石蜡切片),肝脂肪变性(冰冻切片),脂肪特染：苏丹III,糖原累积症,PAS（+）PAS（-）肝细胞癌胆管癌横纹肌瘤颗粒细胞肌母细胞瘤Ewing肉瘤骨的网织细胞肉瘤,（四）注意事项,1.过碘酸溶液与Schiff试剂均可反复使用多次，用后密封放入冰箱4保存2.新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，刚配成的作用时间短，以后逐渐延长3.过碘酸溶液在作用前应与室温接近，温度太低，造成氧化不全，影响效果4.Schiff试剂如呈淡红色，则应弃去重配,5.Schiff试剂配法很多，区别不大，可以随意选用6.Schiff试剂作用时，染色缸必须加盖，不然Schiff试剂将因SO2消失而失效,Schiff试剂,碱性复红1g1N盐酸20ml偏重亚硫酸钠1g重蒸馏水200ml,粘液物质(粘多糖),人体的各种腺体及其他许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为粘多糖或粘液,分类,中性粘多糖酸性粘多糖1.硫酸化粘液物质结缔组织（强）上皮（弱）2.非硫酸化粘液物质含己糖醛酸的结缔组织粘液物质含唾液酸的上皮粘液物质,粘液物质染色在诊断中的应用,用于一般粘液性病变的观察肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的染色方法进行观察和鉴别,胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液-AB-PAS染色区分中性与酸性粘多糖酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不同的PH值及不同的电解质浓度，可以区别酸性粘多糖的二种基团-HID-AB法,不同PH的竞争性抑制PH2.5时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色PH1.0时，仅硫酸粘多糖着色,2.电解质浓度与粘液物质着色的关系,MgCl2浓度显示物0.06M羧酸和硫酸化粘液0.3M弱和强硫酸化粘液0.5M强硫酸化粘液0.7M强硫酸化结缔组织粘液0.9M硫酸角质,显示糖分子和酸性基团的组化方法,1.奥蓝-过碘酸Schiff氏法（AB-PAS）,【目的】鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义,【染色原理】,奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与PAS发生反应；仅中性粘多糖为PAS阳性,【染色步骤】,1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗2.1%奥蓝的醋酸（3%）液染30分钟（PH约2.5）3.蒸馏水洗4.1%过碘酸液氧化5-10min5.蒸馏水洗6.Schiff试剂作用10-30min7.流水洗10min8.脱水，透明，封片,Alcinblue染色液：奥蓝1g，蒸馏水97ml，冰醋酸3ml临用前过滤使用，调节PH2.5-3之间【结果】中性粘多糖（胃粘液）呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色,AB-PASX100,AB-PASX200,2.高铁双胺-奥蓝法（HID-AB）法,【目的】主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性粘液小肠氮乙酰化唾液酸粘液大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液,肠型胃癌唾液酸粘液硫酸粘液弥漫型胃癌中性粘液高分化腺癌硫酸粘液中低分化腺癌唾液酸粘液大肠型化生硫酸粘液小肠型化生不含硫酸粘液,高铁双胺染液,N，N-二甲基-间-苯二胺二盐酸盐120mgN，N-二甲基-对-苯二胺二盐酸盐20mg溶于预热至25的蒸馏水50ml中，再加入60%FeCl3.6H201.5ml(PH1.4-1.5),【染色原理】,二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。该反应缓慢，需加入FeCl3作为催化剂FeCl3的作用-使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色-使染色液的PH降至1.4以后奥蓝（PH2.5）把羧基化的唾液酸粘液染成蓝