荧光定量PCR技术讲座：理论基础、引物及探针设计、内参选择、体系优化、实验方案、数据分析、污染防控

荧光定量PCR技术讲座,-分子生物学实验技术系列讲座,张志坤2013、08、08,郑州瑞德生物技术有限公司郑州瑞德基因技术研究中心,郑州瑞德生物技术有限公司郑州瑞德基因技术研究中心,前言现代生物科学完全是建立在实验技术上的一门学科，每一次技术的进步都极大地提高了生物科学的理论水平。从显微镜的发明到细胞学说的诞生，从孟德尔的豌豆实验到遗传学第一、第二定律的提出，从X射线衍射技术对核酸结构的分析到DNA双螺旋结构模型的建立，从测序技术的进步到人类基因组计划的完成.还没有哪一门学科的进步像生物学这样如此依赖于实验技术的提升。生命科学的进步完全依靠对生物体内微观生命现象的研究，这就要求研究者在实验时必须严谨、精细，必须一丝不苟地注意实验中的每一个环节，精细地操作每一步实验，一丝不苟的分析每次的实验结果，步步为营，细节决定成败。,简介,大纲,一、荧光定量PCR技术的基础理论二、引物及常见荧光探针的设计三、内参基因的选择四、反应体系的优化五、实验方案的选择六、误差分析及操作规范七、实验中污染的防控八、SNP及稀有突变检测九、实验结果的分析,一、荧光定量PCR技术的基础理论,1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术产生并成熟于上世纪90年代，由于该技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，能够对PCR反应的全过程进行实时监控，并且自动化程度高，所以该技术从产生到现在短短的十几年时间，在科研及检验领域获得了广泛的应用，成为分子生物学领域不可或缺的一项重要技术。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,1、荧光定量PCR技术概论荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。系统组成：定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,2、荧光定量PCR常用的三个概念扩增曲线、阈值、CT值（1）、扩增曲线及扩增曲线的两种形式,左图反映的是随着PCR反应的进行相应的荧光信号的变化，比较直观，但是指数期很短；右图反映的是荧光信号的变化量的对数与PCR反应循环数的关系，从右图可知，指数期很明显，在确定阈值线时具有简单明了的特点，所以很多软件都采用右图的形式，当然了，这两种实时扩增曲线可以根据实验的需要相互转换。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,2、荧光定量PCR常用的三个概念（2）、阈值线在荧光定量PCR扩增的指数期，画一条线，在此直线上，所有样品的荧光强度与其本底荧光强度的差值全部相同。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,2、荧光定量PCR常用的三个概念（3）、CT值PCR过程中，各样品扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础荧光定量PCR是随着PCR循环的进行，以荧光信号强度的积累来实时反映PCR反应进程的。理想的荧光物质需具备以下特点：（1）、本底低（2）、单位荧光强度高（3）、每轮PCR反应完成后都有荧光强度的增高，而且这种荧光强度的增高和每轮循环后PCR产物的量成线性关系（4）、没有PCR产物时，没有荧光（5）、该荧光物质的受激发后其发射光的波长范围窄，各种荧光不会产生荧光的交叉干扰,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础目前常用的几种荧光物质（1）、Taqman探针类,5端标记荧光基团，3端标记淬灭基团，探针完整时，没有荧光，探针断裂后，在激发光的作用下，荧光基团产生荧光；探针本身序列与目的基因序列互补，特异性高，退火后探针与目的基因互补序列结合，随着PCR反应的进行，在Taq酶5-3外切酶的作用下，探针水解断裂，荧光产生。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础Taqman常用的荧光基团和淬灭基团荧光基团：5端常用荧光基团FAM标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大发射光波长：518-520nm。淬灭基团：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。TAMRA本身也是一种荧光基团，激发光波长范围较宽，500560nm，最佳激发光波长在560nm附近，对FAM基团产生的发射光具有较好的吸收作用；其发射光波长较宽，560650nm，当做多重荧光时，容易产生荧光交叉干扰，并且本底较高，故现已不常用。BHQ和ECLIPSE为非荧光物质，只是一种荧光淬灭剂，本身不会产生荧光，光吸收范围较宽，因此本底较低，作为淬灭基团较为常用，尤其在多重荧光定量PCR时常常被采用。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础Taqman探针的特点及应用（1）、特异性强、准确性高本身具有序列特异性，保证了所检测目的基因的特异性；其结构特点保证了其所产生的荧光强度与PCR产物的量成正比关系，因此准确性极高。（2）、对引物及试剂要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能满足实验的要求。（3）、常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。（4）、水解类探针，需要Taq酶5-3聚合酶及外切酶活性。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础（2）、荧光染料类目前常用的荧光染料为SYBRGreen、SYBRGreen、SYTO9等。其共同性质为：（a）、结合于双链核酸的小沟处（b）、与双链DNA结合后受激产生荧光（c）、在变性条件下双链分开，荧光消失,一、荧光定量PCR技术的基础理论,3、荧光定量PCR的化学基础荧光染料的特点及应用（1）、能够与所有的核酸双链结合，受激后产生荧光，其荧光的强度与双链核酸的含量及长度成正比，因此本底较高；（2）、可做双链核酸的熔解曲线分析；（3）、SYBRGreen染料本身价格便宜，但是做荧光定量PCR时对引物设计的要求很高；对Taq酶要求较高，最好是HotStarTaq酶，或者操作时需要严格的冷启动，冰上操作，否则引物二聚体及非特异性扩增会严重干扰结果的准确性，尤其是模板含量较低时；（4）、适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；（5）、在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（6）、对PCR反应的毒性，能抑制PCR反应，降低PCR反应的效率。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,4、荧光定量PCR的数学原理对于普通的PCR反应来说n,Xn=X0（1E）,上式中，Xn为n轮PCR循环后，目的基因PCR产物的量；n为PCR循环数；X0为目的基因的初始模板量，E为PCR的反应效率，0E1。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,4、荧光定量PCR的数学原理由于PCR反应体系中荧光物质的荧光强度与PCR产物的量成正比，所以用荧光强度来代替PCR产物的量，我们可以得到：Rn=RB+X0(1+E)Rs,n,总荧光信号强度=本底信号+PCR产物分子数量单位信号强度,Rn：第n个循环时的总信号RB：本底RS：每轮PCR循环增加的单位荧光信号强度X0：起始DNA数目E：PCR效率,一、荧光定量PCR技术的基础理论,4、荧光定量PCR的数学原理当循环数n等于CT值时，所有样品荧光信号强度变化量的对数全部一致，都达到了阈值。RT=RB+X0(1+E)Rslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)lgRs,CT,此时，PCR反应处于指数期阶段，所有样品的反应效率E稳定且近似相等；lg(RT-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0为变量，且这两个变量之间成一次性方程。也就是说，所有样品的lgX0与到达阈值时的循环数n（Ct值）呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,一、荧光定量PCR技术的基础理论,5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析,（1）、PCR效率相等，在PCR扩增的指数期，E稳定且为常数；（2）、RTRB要相等；也就是说到达阈值时样品的荧光强度与样品的荧光本底之差要相等；（3）、样品的单位信号强度Rs要相等，用荧光染料做荧光基团时，Rs就是每条PCR产物结合荧光染料后所发出的荧光强度，此荧光强度和PCR产物的长短有关，PCR产物越长，结合的荧光染料越多，Rs值越大；用探针做荧光基团时，Rs就等于每一轮PCR反应Taq酶水解掉探针，探针的发光基团所发出的荧光强度，和PCR产物的长度没有直接关系。不同的荧光基团，其Rs不同。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析,左图横坐标是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度Rn，横坐标反映的是各个样品随着每轮PCR反应，其总的荧光量的实时变化；右图横坐标也是PCR循环次数，纵坐标是总的荧光强度与荧光本底的差值（RTRB）即Rn的对数(lgRn)，在右图中确定阈值线，该直线上所有样品的（RTRB）都相同，荧光定量PCR的线性关系才会成立。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,5、荧光定量PCR线性关系成立的条件分析,LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,6、双链核酸的熔解曲线分析使用荧光染料作为荧光基团时，由于荧光染料的特性随着PCR反应的进行，双链PCR产物呈指数增长，SYBRGreen与双链PCR产物结合后荧光越来越强，当PCR反应结束时，荧光强度达到最大，此时对PCR产物进行缓慢加热，从50一直加热到99，在此过程中PCR产物按照TM值的小大顺序双链被依次打开，荧光强度也随着双链的打开依次减弱，如下图：,一、荧光定量PCR技术的基础理论,6、双链核酸的熔解曲线分析对于核酸序列相同的PCR产物，其TM值也相同，而且其TM值在一个很小的温度范围内，在此温度区间，其序列相同的核酸双链全部打开，荧光强度急剧降低，以荧光强度的变化率和温度来作图，则可得到如下图：,一、荧光定量PCR技术的基础理论,6、双链核酸的熔解曲线分析上图就是熔解曲线，熔解曲线反映的是一定序列长度的核酸双链，在一定的离子强度下的TM值。核酸双链的TM值由双链核苷酸之间相连接的氢键决定，不同的核酸双链，其TM值也不同，所以通过熔解曲线，我们能获知双链核酸的均一性、野生型和突变型双链之间的碱基差异等，如果采用高分辨率荧光染料，链条核酸双链哪怕只有一个碱基的差异，通过熔解曲线也能分析出来。电泳是通过核酸分子量的大小和构象来分析的，熔解曲线是根据双链核酸的TM值来分析的，这与琼脂糖电泳及SSCP有异曲同工之处。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,7、绝对定量和相对定量,一、荧光定量PCR技术的基础理论,7、mRNA差异表达的相对定量分析研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。实验操作中，由于样品选取时样品的细胞个数不可能完全相同，RNA提取时得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看内参基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的内参基因是在各种组织及各种生理条件下表达量恒定的基因，这些基因也常被称为看家基因，该基因表达一般不随组织的差异以及外界的变化而变化，所以常被用作内参照，常用的内参基因有GAPDH基因、-Actin基因，18srRNA基因等。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,7、mRNA差异表达的相对定量分析,以上公式就是引入内参基因后相对定量分析的基本公式，并由此派生出两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-deltaCt法。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,7、mRNA差异表达的相对定量分析（1）、双标准曲线法所谓的双标准曲线法就是对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量，求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量，然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达。双标准曲线法的特点：（a）、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误差；（b）、思路直观、条理清晰、应用简便，操作灵活，无需像Delta-deltaCT法那样对实验进行反复的优化；（c）、其不足之处是每轮PCR反应都需要做对应基因的标准曲线；（d）、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。,一、荧光定量PCR技术的基础理论,7、mRNA差异表达的相对定量分析（2）、2-CT法,该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。,二、引物及常用荧光探针的设计,1、染料法引物的设计原则：（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨外显子；（3）、引物的碱基构成决定着除反应体系之外的PCR扩增效率，尤其是引物3端附近的碱基构成，3端附近5个碱基构成中，GC碱基最好不低于两个，且3端最好为C或G。（4）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构，避免引物自身或与引物之间形成连续配对的引物二聚体结构，避免引物自身形成环状发卡结构（扩增效率低）；（5）、目的基因和内参基因所扩增的PCR产物长度尽量一致，不大于300bp，这样有利于使两种基因PCR效率相同；并将PCR结果测序验证PCR产物的忠实性；（6）、须知荧光定量PCR所扩增基因片段是能代表该基因的，所以其引物必须能特异性的代表该基因，必须将设计好的引物在NCBI上做BLAST分析，特异性合格才能使用。,二、引物及常用荧光探针的设计,1.1、染料法引物设计之-PCR扩增效率以国标GB/T20190-2006饲料中牛羊源性成分检测标准为例，在检测中我们发现，牛羊源性成分含量一致（1%）的标样，PCR扩增牛羊源成分时，羊源性PCR扩增产物电泳检测总是低于牛源性PCR扩增产物。牛P1：5-GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3牛P2：5-GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3羊P1：5-TATTAGGCCTCCCCCTTGTT-3羊P2：5-CCCTGCTCATAAGGGAATAGCC-3在羊源性引物P1中，3端5个碱基中，只有一个G，其余都是T，这样的碱基构成在复性温度时，易导致3附近碱基与模板结合不稳定，尽管引物羊P1整体TM值为60左右，但是羊P1引物3附近在复性温度时还是局部不稳定，从而导致羊源性PCR扩增效率降低。,二、引物及常用荧光探针的设计,二、引物及常用荧光探针的设计,如上图，HLA-G基因在人体中有7种常见的亚型，这七种亚型分别是HLA-G基因的外显子和内含子按不同的剪辑拼接方式所形成，这也构成了HLA-G基因的7种多态性，这七种亚型的构成分别为：HLA-G1（e1e2e3e4e5e6e8）;分别在e3和e4、e4和e5外显子连接处设计上下游引物HLA-G2（e1e2e4e5e6e8）;分别在e2和e4、e4和e5外显子连接处设计上下游引物HLA-G3（e1e2e5e6e8）;在e2和e5外显子连接处设计引物HLA-G4（e1e2e3e5e6e8）;分别在e2和e3、e3和e5外显子连接处设计上下游引物HLA-G5（e1e2e3e4i4e5e6e8）;分别在e3和e4、e4和i4连接处设计上下游引物HLA-G6（e1e2e4i4e5e6e8）;分别在e2和e4、e4和i4连接处设计上下游引物HLA-G7（e1i2）;在e1和i2连接处设计引物如何设计引物才能保证所扩增PCR产物能特异性的代表HLA-G基因的七种亚型呢？,1.2、染料法引物设计之-如何确保PCR的特异性,二、引物及常用荧光探针的设计,1.3、染料法引物设计之-如何避免引物二聚体,最易形成引物二聚体的引物碱基构成，在加样操作阶段，大量的引物在此结构下扩增，形成初级引物二聚体，其二聚体TM值随之升高，PCR阶段，这些引物二聚体进而再与引物结合，随着PCR反应的进行而大量扩增。减少引物二聚体形成的方法：（1）、引物设计时杜绝此类易引起二聚体形成的引物设计；（2）、不能杜绝此类结构的引物时，尽量使用热启动酶或执行严格的冰上操作，以减少引物二聚体的滋生。,二、引物及常用荧光探针的设计,2、探针的定义以及分类在生物学中，探针是一小段单链DNA或者RNA片段（20-500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。,探针分类,水解类探针：随着PCR反应的进行，探针在Taq酶5-3外切酶的作用下水解成单核苷酸，此类探针有TaqMan、TaqManMGB探针等。杂交类探针：在PCR反应中，该类探针不水解，仍保持完整状态，只是随着PCR反应的变性与复性而变性与复性，从而产生荧光，此类探针包括分子信标、蝎型探针、二倍体引物探针、FISH探针等。此类探针的设计对TM值的要求较为严苛。,二、引物及常用荧光探针的设计,3、什么是荧光？荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。常见的荧光基团：激发光波长（nm）发射光波长（nm）FAM：494518HEX:533559ROX:587607CY5：643667TAMRA：560582BHQ系列荧光淬灭剂吸收光谱很广，从430nm一直到近红外，用作淬灭基团的话，其探针本底更低。,二、引物及常用荧光探针的设计,4、荧光共振能量转移（FRET）当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子）的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光或热能，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为710nm时即可发生FRET;随着距离延长，FRET呈显著减弱。,荧光探针中的发光基团就是标记到核酸序列上的荧光分子，淬灭基团可以是能吸收荧光基团特异波长的荧光分子，如FAM-TAMRA；也可以是单纯的荧光淬灭基团，如FAM-BHQ，此时发光基团的荧光被淬灭基团BHQ吸收后转化为热能。,二、引物及常用荧光探针的设计,5、荧光探针设计的关键1、探针序列的特异性这一点无需赘述，探针序列肯定要和所检测基因的核酸序列一致；2、探针序列的TM值探针的TM值直接影响着探针和靶序列的结合，我们知道PCR反应过程由三个温度阶段，变性阶段、退火阶段、延伸阶段，假如探针TM值过低，则探针后于引物与靶序列结合，探针不起作用；尤其是设计突变检测探针时，探针的TM值尤其重要，可以说TM值是探针设计中关键。,二、引物及常用荧光探针的设计,6、Taqman探针及引物的设计原则：在Taqman探针法中，Taq酶除了5-3聚合酶作用之外，还要5-3外切酶的活性来切断探针链产生荧光，普通PCR的延伸温度为72，此温度为Taq酶聚合作用的最佳温度；Taqman探针法反应中，在要求Taq酶5-3聚合酶活性的同时，还需要Taq酶5-3外切酶的活性来切断探针链产生荧光，Taq酶5-3外切酶活性的最佳温度为60，所以TaqmanPCR反应的一般采用两步法，即95变性，60复性延伸。在Taqman探针及引物的设计过程中，引物的TM值已经确定为60左右，在每轮PCR循环的复性过程中（9560），为了确保探针先于引物与模板结合，这就要求探针的TM值高于引物10左右，所以Taqman探针及引物一般都是引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右。,二、引物及常用荧光探针的设计,二、引物及常用荧光探针的设计,6、Taqman探针及引物的设计原则：（1）、序列选取应在基因的保守区段，不能有碱基变异；（2）、检测mRNA时，为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；（3）、引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右；（4）、探针的5端应避免使用鸟嘌呤G，因为5G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；（5）、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；（6）、引物之间的TM相差避免超过2；（7）、典型的引物长度为18-24bp，探针长度为15-45bp；（8）、PCR产物长度在50-150bp之间，这样有利于使PCR效率相同；（9）、将设计好的引物用序列分析软件分析其二级结构并做BLAST分析其特异性,二、引物及常用荧光探针的设计,6、Taqman探针及引物的设计原则：,探针中GC含量的差异对定量PCR荧光信号强度的影响,二、引物及常用荧光探针的设计,6、Taqman探针及引物的设计举例1ATGAACTACGTTGGACAGTTAGCAGGGCAAGTGTTTGTAACTGTGAAGGAGCTCTATAAG61GGACTAAACCCAGCCACGCTGTCGGGATGTATCGATATAATTGTTGTACGTCAGCCAGAT121GGGAATCTTCAGTGTTCTCCATTCCATGTACGCTTTGGGAAAATGGGAGTTCTGCGTTCC181AGGGAGAAAGTGGTTGACATAGAAATTAATGGAGAGGCTGTAGATTTGCACATGAAGCTA241GGAGACAATGGAGAAGCCTTTTTCGTCCAGGAGATGGATAACAATCAGGAGGTAATTCCT301TATCATCTGTCTACGTCCCCCATCCTGTCTGAGGGAACTGCGTTAATGGAAGCTCAGCTG361AAGAGAAACTCAATTGACAGGATAAGAAACCTGGACAGCAGTGTATCTTCACAAGTACCA421CCCCAAGCTCATGGATCCCAGCCTGGTACTGAAACATCTCCAGCCTGTAGCTCTGTGAAA481AAGAGGAGGAAAAAGAGGAGGAAGTCTACCCACAAAATAGACAGCTTAAAAAGAGAAGAC541ATTGGAGATACATCAGAAGATGAAGACATGTTTCCTATAGAGATTAGCTCAGAGGAAGAA601AAGGAACAATTGGACAATTCAAGGATTCTTGTTCCAGATGTGTTTGTTGATGAAGTATCT661GATATAAAGGCTCCTGCTGTTTCTGCTTATTCTCAGTCTTCATCTTACCCTCGTTCGGAT721GGAGAATGGTCACCCATTCAAAGTAAGCCCATAGATTACACAGGGCAATCCTCTCTTCTC,经Oligo软件验证，探针TM值70左右，上下游引物的TM值都为60左右，二级结构分析，引物和探针比较理想，再经BLAST分析，引物和探针特异性较好。,二、引物及常用荧光探针的设计,6、Taqman探针及引物合成时注意事项（1）、引物及探针设计好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）、先不要急于合成探针，先引物合成，引物合成好以后，做普通PCR，电泳检测PCR产物，看是否和设计的长度吻合，再看看非特异性扩增情况，必要时进行PCR产物的测序验证；（3）、确定引物没有问题后，再将探针送交合成，这样安排能避免很多意外的损失；（4）、探针合成好后，先检测一下探针的质量，250nm的探针终浓度，25ul水，反应体系中只有水和探针，在荧光定量PCR仪上检测，95，2min;95，20s，60，20s，40个cycles；看荧光本底和荧光强度的变化情况，好的探针荧光本底较低，随着PCR反应，荧光强度不会变化，假如荧光强度变化的比较大，说明探针合成质量较差，建议重新合成。检测探针的本底和热稳定性。,二、引物及常用荧光探针的设计,7、TaqManMGB探针TaqManMGB探针的原理与TaqMan探针原理相同，都是水解类探针，探针都是通过Taq酶5-3外切酶活性被水解成单核苷酸，从而使得荧光基团与淬灭基团彻底分离而发出荧光；所不同的是TaqManMGB探针的3端通过一段MGB（MinorGroovebinder,小沟结合物）与淬灭基团（BHQ等）相连，MGB与模板靶序列的小沟部位结合，形成特定的结构，与普通TaqMan探针相比TaqManMGB探针与靶序列结合得更加稳定，其TM值要高出普通TaqMan探针16-18度左右，所以在相同的TM值条件下，TaqManMGB探针序列可以设计的更短（12-17bp）；而且探针序列的特异性更高，因为只要有一个碱基与靶序列不匹配，其MGB与模板靶序列的小沟部位结合就会受到影响，进而使探针TM值大大降低，在60的退火温度下，序列不匹配的探针不能与模板靶序列结合，PCR反应过程中检测不到荧光信号。所以TaqManMGB探针非常适合用于检测基因突变（点突变、缺失突变、插入突变、融合突变等），当然了，TaqManMGB探针同样可以用于定量试验。,二、引物及常用荧光探针的设计,二、引物及常用荧光探针的设计,二、引物及常用荧光探针的设计,8、分子信标（MolecularBeacon）分子信标（molecularbeacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-15个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。随着每轮PCR产物的增加，分子信标也是积累荧光。常用的淬灭基团为DABCYL，荧光基团为EDANS。,二、引物及常用荧光探针的设计,二、引物及常用荧光探针的设计,分子信标在PCR过程中的作用过程：1、95热变性阶段，探针发夹结构全部打开，探针荧光信号全部释放；2、引物TM值茎TM值环TM值延伸温度；3、温度降至环部TM值时，环部序列与靶序列结合，产生荧光；温度降至茎部TM值时，茎部闭合，多余探针荧光消失，检测荧光信号；温度降至引物TM值时，引物与模板结合；温度升至延伸温度时，环部解离靶序列，PCR扩增。4、重复上述1、2、3步骤，在茎部TM值时采集荧光信号，由于前一轮PCR产物的增加，所以更多的探针与靶位结合，产生更多的荧光被检测到；5、1、2、3步骤的重复。6、由此我们可以看出，分子信标在设计时，TM值的重要性，颈部发夹结构的TM值、环部序列的TM值、引物的TM值，以及延伸温度，都要设计好。,二、引物及常用荧光探针的设计,9、扩增阻碍突变系统（ARMSPCR）扩增阻碍突变系统(AmplificationRegractoryMutationSystem,ARMS)技术，又称等位基因特异性PCR，也叫序列特异性引物PCR，是设计两条上游引物，其中一条引物的3端碱基与野生型3端完全相同，另一条引物的3端碱基与突变型3端完全相同，由于Taq酶缺乏3-5外切酶校正活性，在PCR反应进行时，位于引物3末端的特异性碱基分别结合于野生型和突变型等位基因的位点，若此碱基对形成错配，DNA链延伸反应就会因为3-5一磷酸二酯键形成障碍而受阻。但是ARMS引物3末端碱基对不同错配区分能力不同，因此对有些突变的区分能力有限，后续有学者在ARMS引物设计时在引物内部尤其是3端临近引入错配碱基，以便提高ARMS引物的特异性。,二、引物及常用荧光探针的设计,9、扩增阻碍突变系统（ARMSPCR）1ATGAACTACGTTGGACAGTT（G）AGCAGGGCAAGTGTTTGTAACTGTGAAGGAGCTCTATAAG61GGACTAAACCCAGCCACGCTGTCGGGATGTATCGATATAATTGTTGTACGTCAGCCAGAT121GGGAATCTTCAGTGTTCTCCATTCCATGTACGCTTTGGGAAAATGGGAGTTCTGCGTTCC181AGGGAGAAAGTGGTTGACATAGAAATTAATGGAGAGGCTGTAGATTTGCACATGAAGCTA241GGAGACAATGGAGAAGCCTTTTTCGTCCAGGAGATGGATAACAATCAGGAGGTAATTCCT301TATCATCTGTCTACGTCCCCCATCCTGTCTGAGGGAACTGCGTTAATGGAAGCTCAGCTG361AAGAGAAACTCAATTGACAGGATAAGAAACCTGGACAGCAGTGTATCTTCACAAGTACCA421CCCCAAGCTCATGGATCCCAGCCTGGTACTGAAACATCTCCAGCCTGTAGCTCTGTGAAA481AAGAGGAGGAAAAAGAGGAGGAAGTCTACCCACAAAATAGACAGCTTAAAAAGAGAAGAC541ATTGGAGATACATCAGAAGATGAAGACATGTTTCCTATAGAGATTAGCTCAGAGGAAGAA601AAGGAACAATTGGACAATTCAAGGATTCTTGTTCCAGATGTGTTTGTTGATGAAGTATCT661GATATAAAGGCTCCTGCTGTTTCTGCTTATTCTCAGTCTTCATCTTACCCTCGTTCGGATGGAGAATGGTCACCCATTCAAAGTAAGCCCATAGATTACACAGGGCAATCCTCTCTTCTCF：ATGAACTACGTTGGACAGTG为了确保扩增的特异性，可以采取引入错配碱基：ATGAACTACGTTGAAGACAGTG，从而使得突变的引物只能特异性扩增突变的序列，而不能扩增野生型序列。,二、引物及常用荧光探针的设计,10、二倍体引物探针二倍体引物探针就是将上游或下游引物作为探针，其发光基团标记于引物的5端，同时另一条与之完全互补的序列上的5端标记上淬灭基团，平常情况下，两条链互补结合，荧光基团所发荧光被与之互补的核酸链上5端的淬灭基团所淬灭，整体没有荧光产生；当PCR反应时，荧光引物的5端被下游引物延伸，原来与荧光链互补的淬灭连被PCR延伸的碱基所替代，荧光产生。此类探针也叫二倍体探针，因为同时还要行使引物功能，所以也叫二倍体引物探针1ATGAACTACGTTGGACAGTAGCAGGGCAAGTGTTTGTAACTGTGAAGGAGCTCTATAAG61GGACTAAACCCAGCCACGCTGTCGGGATGTATCGATATAATTGTTGTACGTCAGCCAGATGGGAATCTTCAGTGTTCTCCATTCCATGTACGCTTTGGGAAAATGGGAGTTCTGCGTTCCF：R-ATGAACTACGTTGGACAGTQ-TACTTGATGCAACCTGTCAR：GGAACGCAGAACTCCCATTT,二、引物及常用荧光探针的设计,11、蝎型引物探针（ScorpionARMS）ARMS特异引物的5端通过HEG（线性多聚体）与二倍体探针相连，二倍体探针的核酸序列与PCR产物中的一段序列完全互补，这就构成了ScorpionARMS引物探针系统。其中，ARMS引物特异性的扩增突变序列，二倍体探针的荧光链与部分PCR产物互补结合与二倍体探针中的淬灭链分离从而产生荧光信号，且荧光信号随着PCR产物的增多而增强，这样就非常巧妙的组成了一套专一检测突变序列的系统-ScorpionARMS引物探针系统。,二、引物及常用荧光探针的设计,三、内参基因的选择,1、理想的内参基因具有的特点（1）、不存在假基因；（2）、高度或中度表达，排除太高或低表达（3）、稳定表达于不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)，而且其表达量是近似的，无显著性差别；（4）、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；（5）、不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。理想的内参基因很少或者说不存在，因为所有基因在不同的细胞或组织中、在细胞的不同生理时期、在不同的理化等外界刺激下，其表达量都会有所差异，有时可以是几倍、几十倍甚至是上百倍的差异。盲目地使用一种看家基因作为内参，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能引致错误甚至相反的结论。,三、内参基因的选择,2、常用内参基因的表达情况（1）、GAPDHGAPDHmRNA在不同癌组织(包括肺癌、乳腺癌、肾细胞癌等)中的表达升高，在不同个体间、怀孕期间以及细胞周期的不同阶段等变化很大，在正常的结肠上皮、人类前列腺癌的细胞周期不同阶段也呈现出显著性变化。在各种因素(例如低氧、胰岛素、地塞米松、丝裂原、表皮生长因子等)刺激下，培养细胞GAPDHmRNA的表达水平也不同。（2）、-actin当细胞向恶性转化时，-actinmRNA的表达水平增加。（3）、18srRNA当细胞有丝分裂时，18srRNA表达量显著上调。,三、内参基因的选择,3、内参基因的选择策略根据实验的实际情况，不同组织、不同细胞、细胞的不同生理时期、不同的理化条件刺激等，查阅相关资料，选取三、四合适的内参基因，做荧光定量PCR，先以CT值最小的那条基因作为内参，其他几条内参基因与其相比，分析所得的比值，找出比值稳定的几条基因，比值稳定说明该基因表达稳定，适合作为理想的内参。也可用geNorm内参分析软件来选择合适的内参基因。对于比较精确的实验，最好采用两种或两种以上表达稳定的基因作为内参，对每种内参基因测得的基因表达变化求方差和平均值。http:/medgen.ugent.be/jvdesomp/genorm/index.php,四、反应体系的优化,1、为什么要优化反应体系影响PCR反应效率的关键因素为：引物、Taq酶活性及耐热性、Mg2+浓度。引物对PCR效率的影响在第二节已论述过，本节主要论述反应体系对PCR效率的影响。与普通PCR反应相比，荧光定量PCR在反应中加入了荧光物质，用以实时显示反应的进程，Taqman探针法在普通PCR反应体系中加入了与扩增片段互补的一段带荧光标记的核酸序列，Taq酶除了5-3聚合酶作用之外，还要发挥5-3外切酶的活性来水解探针链来产生荧光；SybrGreen法加入了能与双链核酸结合的荧光染料，这些荧光物质都能影响Taq酶的活性进而影响PCR的反应效率。,普通PCR反应体系模板引物Taq酶BufferMg2水,定量PCR反应体系模板引物荧光基团Taq酶BufferMg2水,四、反应体系的优化,1、为什么要优化反应体系,普通PCR结果电泳图,添加荧光基团后PCR结果电泳图,四、反应体系的优化,2、如何优化由上图可知，添加荧光基团后，PCR的反应效率几乎为0，所以必须对荧光定量PCR反应体系进行优化，对体系中各个反应成分的浓度进行调整。其中最关键的因素：TaqE活性（聚合/外切）及耐热性、Mg2浓度理想的TaqE必须具有很强的聚合及外切酶活性以及耐热性。对于SYBRGreen荧光染料定量PCR反应体系来说，Mg2的最佳浓度为3.0-4.0mM；对于Taqman探针反应体系来说，Mg2的最佳浓度为5.0mM左右，引物最佳浓度为500nM，探针的最佳浓度为250nM。,四、反应体系的优化,2、如何优化,不同TaqE扩增性能比较,四、反应体系的优化,2、如何优化,SYBRGreen反应体系中Mg2浓度梯度优化PCR电泳结果,四、反应体系的优化,2、如何优化,优化后的Taqman探针体系实验结果，Mg2浓度为5.0mM左右，引物浓度为500nM，探针浓度为250nM。,四、反应体系的优化,3、自行配制荧光定量PCR试剂（1）、常用的SYBRGreen预混酶（2X）HotStarTaqEBufferMg2其中Mg2浓度为8-10mM（2）、常用的Taqman预混酶（2X）TaqEBufferMg2其中Mg2浓度为8-10mM,五、实验方案的选择,定量PCR实验方案,定量PCR实验方案,荧光染料法,Taqman探针法,双标准曲线法,2-CT法,双标准曲线法,2-CT法,五、实验方案的选择,定量PCR实验方案（1）、染料法适合于基因含量及基因表达变化的粗略分析或初筛；在分析的基因种类很多，但是样品量很少时，尤其适用。（2）、探针法适合常被用作基因含量的精确检测(精确度可达几十个拷贝)及基因表达变化的精确分析（精确度可达0.1倍的变化）。（3）、双标准曲线法适合样品量大、检测的基因种类相对较少、精度要求较高的实验。（4）、2-CT法适合检测精度要求一般，样品量相对较少，检测的基因种类相对较多的实验。根据实验的实际情况，如检测的精度要求、样品数量、基因数量、经费情况等来选择合适的实验方案。,六、误差分析及操作规范,1、误差分析（1）、实验样品间的个体差异；（2）、实验方案本身的误差；荧光染料法由于染料本身的特性，不可避免的会引起误差；2-CT法由于也是一种近似的算法，所以不可避免的也会引起误差；探针法误差相对较小；双标准曲线法误差相对较小；（3）、仪器设备及耗材引起的误差测量标准品核酸浓度时，分光光度计的误差，从光密度值到质量再到摩尔量，误差本身就很大（双标准曲线法不一定非要测标准品的浓度）；定量PCR仪的误差，96空板封口膜透光性的差异等。,六、误差分析及操作规范,1、误差分析（4）、相对定量时内参基因表达不稳定引起的误差（5）、操作引起的误差样品处理、选取、核酸提取、反转录、加样，操作过程中引起的误差。2、操作规范荧光定量PCR是一项对操作要求很高的实验，同时又是花费很高的一项实验，这就要求必须最大程度的减少误差或避免错误。要想达到这个目标，我们必须从样品的选取开始到上样检测，每一步都要规范操作。（1）、样品的选取及处理科学地选取个体重复，以减少实验个体差异引起的误差；尽量选取表性明显的个体作为实验对象；处理样品时，必须确保样品都得到了充分的处理；选取试验样品时，要保证选取的组织尽可能的纯，不要污染其他组织；样品选取好后，即可放入液氮或超低温冰箱保存。,六、误差分析及操作规范,2、操作规范（2）、核酸提取加入液氮研磨要彻底，蛋白、多糖、多酚类物质要去除干净，确保得到高质量的核酸，分光光度计检测核算质量，RNAOD260/2802.0左右，DNAOD260/2801.8左右，最好再做电泳检测；同一样品要提取2到3个RNA，所剩余的样品不要丢弃，继续低温保存。（3）、得到的RNA立即反转录为cDNA，RNA样品最好不要存放，反转录所得cDNA要用看家基因检测。（4）、对于精度要求较高的定量PCR，最好先在样品的所有组织类型内做内参基因的稳定性分析，找出表达恒定基因作为内参。（5）、做定量PCR时，先把除模板外的所有试剂预混，然后分装到PCR管中，分装时尽量采用排枪，加样时尽量最好采用排枪。（6）、体系中最好掺入ROX参比荧光，以消除光程偏差。,六、误差分析及操作规范,2、操作规范（7）、重复操作让重复操作最大的修正偏差？最有意义的重复是在提取样品RNA时就重复，同一个样品，分别提取3份RNA，3份RNA都做反转录，所得的3份cDNA都做定量PCR检测，这样的重复之所以最有意义是因为我们是把RNA提取、反转录、上机检测三步做了重复，这样得出的平均值要比只在上机检测时对同一cDNA样品做三个重复要有意义的多。同一个cDNA样品做三个重复定量检测求平均值主要是消除加样时的误差，排枪加样时，误差很小，加样时的误差可以通过设几个重复检测出来。（8）根据实验要求选取合适的实验方案，对于样品量大精度要求高的实验尽量选择探针法和双标准曲线法来操作，并且选用精度高的仪器设备和试剂耗材。,六、误差分析及操作规范,2、操作规范,同一cDNA样品的三个重复,六、误差分析及操作规范,模板浓度越低，染料法的误差越大。如图一系列梯度稀释的模板，理论上它们在扩增曲线上的CT值之差，应该相等，但是后边几个浓度低的样品CT值明显提前了，由熔解曲线可知对于浓度低的样品，引物二聚体引起的误差非常严重。,七、实验中污染的防控,1、荧光定量PCR实验中污染源的分析（1）、PCR产物引起的污染在检测过程中，荧光定量PCR产物都是封闭在PCR管中的，不存在开管检测，所以有污染的话，最有可能是因为电泳检测荧光定量PCR产物时引起的污染，只要将电泳室与PCR加样室隔离开，就能有效的避免PCR产物的污染。（2）、标准品引起的污染常用的标准品有含有目的基因的质粒、纯化后的PCR产物等，由于标准品的浓度是一系列从高到低梯度稀释的，所以在稀释过程中，有可能引起污染。（3）、高浓度的样品引起的污染高浓度的阳性样品在加样过程中可能会形成气溶胶，造成污染。,七、实验中污染的防控,2、荧光定量PCR实验中污染的防控（1）、对于PCR产物引起的污染最简单有效地办法就是将电泳室与加样室彻底隔离开，做到每个房间都有专属的移液器，做到移液器专用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解决PCR产物污染的有效办法，但是成本较高。（2）、对于标准品引起的污染目前只能是以预防，加标准品时最好采用专用移液器，不要和加样的移液器交叉使用，加标准品时最好在通风厨中进行，和加样的操作台隔离开。（3）、对于样品间的交叉污染样品间的交叉污染往往是因为高浓度的样品在加样室形成了气溶胶，因为样品的cDNA链较长，经常开紫外灯，把长链cDNA打断，能有效避免此类污染的发生，另外保持加样室空气流通也有助于防止此类污染。,七、实验中污染的防控,2、荧光定量PCR实验中污染的防控（4）、对于未知污染源的顽固的污染的防控这类污染也经常出现，找不到明确的污染源，而且此类污染又非常顽固，对于这种情况，最好的办法就是不去管它，在采用绝对定量和双标准曲线法时，污染的初始模板量可由阴性对照检测出来