基因信息的传递.ppt

第三篇,生物化学,基因信息的传递,第三篇基因信息的传递内容：第十章DNA的生物合成第十一章RNA的生物合成第十二章蛋白质的生物合成第十三章基因表达调控第十四章基因重组与基因工程,本篇内容的学习方法建议：掌握基因信息传递的基本过程；重点掌握基因信息传递、调控和基因工程的机制、重要酶类和主要物质的作用；理清DNA、RNA、蛋白质之间信息传递关系；注意基因信息传递异常与疾病的关系。,第三篇基因信息的传递基因（gene）：生物活性产物编码的DNA功能片段，以碱基排列顺序贮存遗传信息。由Johannsen于1909年首先提出。中心法则(centraldogma)：1958年F.Crick提出。1970年H.Temin发现逆转录现象，补充中心法则。,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,复制,遗传学中心法则,复制,第十章DNA的生物合成DNA的生物合成有DNA复制和逆转录两种方式。DNA复制（DNAreplication）是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板，按照碱基配对原则指导合成子链DNA的过程。,第一节复制的基本规律DNA复制的方式为半保留复制(semi-conservativereplication)DNA复制的形式为双向复制(bidirectionalreplication)DNA复制的过程为半不连续复制(semi-discontinuousreplication),一、半保留复制（semi-conservativereplication）DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板，按碱基配对规律合成与模板互补的子链，形成子代DNA双链，其中一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则是合成的，故称半保留复制。,AGAACTT,TCTTGAA,AGAACTT,TCTTGAA,AGAACTT,TCTTGAA,半保留复制,母链DNA,子链DNA,半保留复制的实验依据1958年，Messelson和stahl用实验证实。1.细菌在含15NH4Cl的培养液中培养若干代，密度梯度离心分离出DNA是含15N的重DNA。图2.把含15N-DNA的细菌放14NH4Cl培养液中培养，子一代DNA是中等密度DNA。图3.继续培养出子二代，其DNA是中等密度DNA与普通DNA各占一半。图,半保留复制的意义按半保留复制方式，子代保留了亲代DNA的全部遗传信息，体现了遗传过程的相对保守性。遗传的保守性是相对的，而不是绝对的。自然界还存在着普遍的变异现象。,DNA复制时，从复制起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。图,二、双向复制(bidirectionalreplication),原核生物是单复制子双向复制。其环形DNA为单复制子，只有一个复制起始点。图真核生物是多复制子双向复制。其线形DNA有多个复制起始点，形成多个复制子。图（复制子是独立完成复制的功能单位，一个复制起始点起始的DNA复制区域称为复制子replicon）。,三、半不连续复制领头链(leadingstrand)：复制方向与解链方向一致的子链。领头链复制是连续的。图随从链(laggingstrand)：复制方向与解链方向相反的子链。随从链的复制是不连续的，形成多个冈崎片段。图冈崎片段（Okazakifragment）：1968年日本科学家冈崎用电镜观察到，原核生物大小在一千至二千核苷酸，真核生物数百个核苷酸。,第二节DNA复制的酶学和拓扑学变化参与DNA复制的酶与物质：1.底物dNTP（N:A,G,C,T）2.DNA聚合酶（DNApolymerase,DNA-pol)3.模板(template)4.解螺旋酶（解链酶）（helicase)5.拓扑异构酶（topoisomerase)6.单链DNA结合蛋白SSB7.引物酶（primase)8.引物（primer)9.DNA连接酶（ligase)10.其他因子,一、复制的化学反应1、复制的基本化学反应：核苷酸和核苷酸之间，通过3,5磷酸二酯键的生成而逐一聚合。反应底物是dNTP，加入单链的是dNMP。图1图22、复制的方向性：新链只能从5-端向3-端延长（所有新生成的RNA或DNA单链其方向都是53，模板链与之反向互补平行）。,3,3,5,5,模板链,新生链,二、DNA聚合酶（DNApolymerase,DNA-pol)（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polIDNA-polIIDNA-pol,1、DNA-pol：结构：由10种亚基（22个亚基）组成的不对称二聚体。其中组成核心酶。图功能：真正的复制酶，亚基具聚合活性。亚基有35核酸外切酶活性和碱基选择功能。图,2、DNA-polII有35核酸外切酶活性和聚合酶活性，主要参与DNA损伤的应急状态修复（sos修复）。,3、DNA-polI单一肽链的大分子，二级结构以-螺旋为主，从A至R共18个-螺旋肽段。I螺旋与O螺旋之间有较大的空隙，可容纳DNA链。图,小片段：AF螺旋区大片段（Klenow片段）：GR螺旋区,polI,323个氨基酸,小片段,5核酸外切酶活性,大片段/Klenow片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性,N端,C端,DNA-pol,Klenow片段是分子生物学常用的工具酶。,DNA-polI作用：切除引物和突变片段；（53核酸外切酶活性）图复制和修复中的空隙填补；（DNA聚合酶活性）复制中的错误校读。（35核酸外切酶活性）图,（二）真核生物的DNA聚合酶DNA聚合酶主要有5种。DNA-pol：具引物酶活性(合成含RNA+DNA的引物)DNA-pol：似DNA-polDNA-pol：线粒体DNA复制酶DNA-pol：真正的复制酶，似DNA-pol，并有解螺旋酶活性DNA-pol：似DNA-pol,（一）核酸外切酶活性和校读35外切酶活性是复制进行中校读辨认错配的碱基并加以切除。53外切酶活性，是切除引物和突变片段。图DNA-polI具有35和53外切酶活性，DNA-pol、II只有35外切酶活性。,三、复制保真性的酶学依据,DNA-pol的亚基有35外切酶活性和碱基选择功能。DNA复制的保真性，依赖三种机制：遵守严格的碱基配对规律;聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能;复制出错时有即时的校读功能。,（二）复制的保真性和碱基选择,四、DNA解链和分子拓扑学变化(一）参与解链的酶与因子主要有解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白1、解螺旋酶（helicase）又称解链酶,复制蛋白rep(replication),DnaB。其作用是利用ATP供能来解开DNA双链。,复制起始时DnaA辨认E.coli上复制起始点oriC（originC），DnaC辅助DnaB(解螺旋酶)结合起始点并打开双链。（DnaADnaBDnaC分别是dnaAdnaBdnaC基因产物)。E.coli基因图,又称DnaG（dnaG基因产物）。作用是催化形成短片段的RNA引物，在其3-OH端开始复制。图引物(primer)：由引物酶催化合成的短链RNA分子。约十数个至数十个核苷酸。,2、引物酶（primase）,3、单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）由177个氨基酸残基组成的相同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸。复制过程中不断与单链DNA结合和脱离。图作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,(二)DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）拓扑：指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。复制解链中的DNA分子绕双螺旋轴高速解链旋转（旋转100次/秒），会造成解链前方的DNA分子缠绕打结。拓扑异构酶改变DNA分子拓扑构象，解除DNA分子缠绕打结。见图,拓扑酶I1.切断DNA双链中一股，切口处的断端绕螺旋轴按照松弛螺旋的方向转动，解除解链旋转中的缠绕打结。2.适当时候又把切口封闭。催化反应不需ATP。,1.切断DNA分子双链某一部位，通过切口使超螺旋松驰，解除解链过程中的缠绕打结。2.在利用ATP供能情况下，断端在拓扑酶催化下恢复连接。,拓扑酶II,五、DNA连接酶（DNAligase）其作用是连接两段相邻的DNA单链片段，使二者生成3,5-磷酸二酯键。需ATP。图,一、原核生物的DNA生物合成（一）复制的起始复制起始点结构：E.coli固定的复制起始点OriC跨度为245bp，包含有3组串连重复序列和2对反向重复序列。图,第三节DNA生物合成过程,复制起始过程：DnaA辨认结合于OriC重复序列，DnaC辅助DnaB结合于OriC附近，解开局部双链，置换出DnaA，DnaG（引物酶）进入，形成引发体（图）。继续解链，SSB结合保护解开的单链，拓扑异构酶发挥作用，引物酶催化生成RNA引物，复制起始完成。图,在DNA-pol催化下以dNTP为原料，以dNMP方式逐个加入到引物或延长中的新链3-OH上，逐个形成3,5-磷酸二酯键。复制方向53，复制特点是半不连续性复制。图1图2DNA复制速度相当快，E.coli20分钟可繁殖一代，每秒可参入2500个核苷酸。,（二）复制的延长,原核生物环状DNA采取单复制子双向复制。领头链和随从链上的RNA引物被RNA酶（或DNA-polI）水解，空隙由DNA-polI来催化填补，DNA连接酶将各片段连接成完整的环状新链，形成两个完整的环状DNA。图1图2,（三）复制的终止,细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞周期可分为：,S期（Syntheticphase,DNA合成期）,G2期（Gap,DNA合成后期）,M期（mitoticphase,有丝分裂期）,G1期（Gap,DNA合成前期）,1.真核生物DNA复制是多复制子双向复制，有多个起始点；2.复制有时序性，复制子以分组方式激活而不是同步起动；,（一）复制的起始,真核生物复制起始与原核生物基本相似，有以下特点：,3.复制起始点序列较原核oriC短。酵母复制起始点含11bp的自主复制序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)。4.DNA-pol具引物酶活性，生成引物（RNA+小段DNA）；DNA-pol具解螺旋酶活性。5.增殖细胞核抗原(PCNA)参与复制起始。其作用与原核DNA-pol的亚基相似，形成钳卡DNA的夹子。,（二）复制的延长,真核生物复制延长与原核生物基本相似，有以下特点：,1.DNA-pol生成引物后，DNA-pol在增殖细胞核抗原PCNA协助下置换DNA-pol。2.DNA-pol在PCNA协助下合成DNA子链。3.引物和冈崎片段较原核生物短，单个复制子复制速度慢，但总体速度不慢。,（三）复制终止和端粒酶1、真核生物复制终止真核生物复制终止与原核生物基本相似。不同点：DNA为线形，复制结束时两条新生子链的5端的引物切下后形成的空隙需端粒酶修补并形成端粒。图,2、端粒（telomere）是真核生物染色体线性DNA分子末端的膨大的粒状结构，由DNA和结合蛋白形成。在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性有重要作用。端粒DNA序列共同特点是富含T、G短序列的重复序列(TnGn)x,3、端粒酶(telomerase)是一种RNA-蛋白质复合物。端粒酶RNA(AnCn)x端粒酶协同蛋白端粒酶逆转录酶,端粒酶,端粒酶以其RNA为模板，在其协同蛋白参与下，其逆转录酶催化生成DNA单链。,端粒酶借助其RNA与DNA单链有互补硷基序列而辨认结合。图以RNA为模板的逆转录，进行母链DNA的延长。图延长以后的单链反折，DNA-pol以其3-OH末端复制DNA单链，填补引物切除后的缺失，DNA连接酶完成连接。图,第四节逆转录和其他复制方式,一、逆转录(reversetranscription),逆转录:以RNA为模板指导合成DNA的过程，因与转录方向相反故称逆转录（反转录）。1970年，H.Temin和D.Baltimore分别从RNA病毒中发现逆转录酶(reversetranscriptase)。此类RNA病毒称逆转录病毒(retrovirus)。,逆转录酶有3种酶活性1.以RNA为模板的DNA聚合酶活性。2.RNase活性，水解杂化链上的RNA。3.以DNA为模板的DNA聚合酶活性。,细胞中的病毒逆转录逆转录病毒在宿主细胞中逆转录生成双链DNA，此又称前病毒。图前病毒可在细胞内独立繁殖，利用宿主RNA聚合酶转录生成病毒RNA，并翻译病毒蛋白质，组装成大量新病毒。前病毒DNA也可整合到宿主细胞基因组中，随宿主基因复制和表达。,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，发展了中心法则。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了病毒致癌理论和病毒性疾病的研究（艾滋病）。逆转录应用于基因工程中（试管内合成cDNA）图。,1、滚环复制(rollingcirclereplication)是某些低等生物环状DNA的特殊复制形式，如M13噬菌体等。A蛋白在复制起始点将DNA外环打开缺口，5端外伸，在3端以内环为模板完成第一次滚动复制。A蛋白切下母链外环，并以此为模板再次滚动复制，最后形成两个环状DNA分子。复制不需RNA引物。图,三、滚环复制和D环复制,2、D环复制(D-loopreplication),是线粒体DNA的复制形式。因复制中呈字母D形状得名。,线粒体DNA复制起始点不在双链同一位点，内外环复制有时序差，复制需引物。先在内环复制起始点以内环为模板复制，至外环复制起始点，以外环为模板反向复制，形成两个子代环状DNA。图,DNA损伤(DNAdamage)或突变(mutation)是指一个碱基或片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化。,第五节DNA损伤（突变）与修复,（一）突变是进化、分化的分子基础自发突变(spontaneousnutation)（二）突变形成DNA的多态性多态性(polymorphism)用来描述同物种个体之间的基因型差别现象。只有基因型改变而没有表型改变的突变形成了DNA的多态性，如简并密码子上第三位碱基的改变等。,一、突变的意义,(三）致死性的突变可致死亡突变发生在对生命过程至关重要的基因上，可导致个体、细胞的死亡。(四）突变是某些疾病的发病基础包括遗传病（血友病、地中海贫血等）；有遗传倾向的疾病（高血压病、糖尿病等）。,物理因素：紫外线和各种辐射。化学因素：化学诱变剂大多数是致癌物。（见书表）生物因素：动物致瘤性病毒等。,二、引发突变的因素,三、突变的分子改变类型,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),（一）错配又称点突变(pointmutation)，DNA上某一碱基的置换。图(二)缺失，插入和框移突变缺失、插入都可导致框移突变。框移突变是三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。图,（三）重排(rearrangement)DNA分子内发生较大片段的交换。图,（一）直接修复（光修复）通过光修复酶(photolyase)催化完成。仅需300-600nm波长照射，使嘧啶二聚体分解为原来的非聚合状态。普遍存在于各种生物。图,四、DNA损伤的修复,（二）切除修复是细胞最重要和有效的修复方式。以原核生物DNA紫外线损伤修复为例：当DNA紫外线损伤时（较大），与修复有关的基因产生UvrA、UvrB、UvrC(uvr=ultra-voiletresistant)。UvrA、UvrB辨认结合DNA损伤部位，UvrC有切除作用，修复过程有DNA-polI及连接酶参加。图,(三)重组修复当DNA分子的损伤面较大，未及修复就进行复制时，损伤部位因无模板指引，复制出的子链会出现缺口。重组蛋白RecA将另一股健康的母链与缺口部分进行交换，以填补缺口。经多次复制后，损伤链所占比例越来越小，把损伤链“稀释”掉。图,（四）SOS修复是DNA损伤广泛而诱发的一系列复杂的修复反应。SOS修复系统包括切除修复基因uvr类产物、重组修复基因rec类产物、调控蛋白LexA等。该系统的反应特异性低，对碱基的识别、选择能力差。SOS修复的结果是DNA保留的错误较多，引起较广泛、长期的突变。,DNA半保留复制的实验证据,含N15-DNA的细菌,培养于14NH4Cl培养液,第一代,第二代,梯度离心结果,培养于14NH4Cl培养液,重DNA,普通DNA,中等密度DNA,DNA,DNA双向复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),5,5,3,3,3,5,3,5,解链方向,3,5,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),冈崎片段,复制的化学反应,67,3,5磷酸二酯键的生成,3,5,35外切酶活性,53外切酶活性,?,切除引物和突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,69,A:DNA聚合酶B:DNA聚合酶,A,B,70,A:DNA聚合酶B:DNA聚合酶,A,B,35外切酶活性,53外切酶活性,?,切除引物和突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,72,E.Coli基因图,解链过程中DNA分子的缠绕打结,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADPPi,5,3,5,3,E.coli复制起始点oriC,3,5,DnaC,DnaB,DnaG,3,5,oriC,DnaB,DnaC,DnaG与