【转基因棉籽DNA提取纯化及快速PCR检测研究】转基因和DNA重组

【转基因棉籽DNA提取纯化及快速PCR检测研究】转基因和DNA重组 摘要以棉籽为原料，探索一种快速、简便的棉籽DNA的提取纯化方法以及PCR检测该棉籽是否为转基因的方法。该方法能从200 mg棉籽中提取0.4 g高纯度DNA，用于PCR检测。针对18S rDNA、CaMV35S、NOS、NPT和CryA（c）等基因进行了棉籽中内外源基因PCR检测，分别扩增出不同的目的片段，为颗粒类产品的外源基因检测提供了可行方法。 关键词棉籽；转基因；DNA提取；PCR检测 S562.035.3 A 1007-5739（xx）03-0032-01 StudyonDNAExtractionPurificationandRapidDetectionofTransgenicCottonseed ZHAO Cheng-ping 1，2YUAN Jian-qin 1，2TANG Zhong-wei 1，2XU Dong-mei 1，2LIU Jian-dong 1，2SHI Zong-yong 1，2 （1 College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu Shanxi 030801；2Transgenic Organism Test Center，Ministry of Agriculture） AbstractIn this paper，a simple and rapid-method which could extracted DNA from cottonseedhad been developed. 0.4 g DNA could be obtained from 200 mg cottonseed. PCR amplification of sequences of CaMV35S，NOS，NPT，CryA（c）and an endogenous reference gene 18S rDNA in refined cottonseed oil was performed. The results showed that the sequence-specific fragments were amplified in the samples，demonstrating that the method could be applied for detection of transgene sequences in refined cottonseed .There are some DNA fragments in refined cottonseed，and PCR amplification can detect the foreign DNA. A feasible method to isolate and detect the foreign DNA in refined cottonseed was provided. Key wordscottonseed；transgenosis；DNA extraction；PCR detection 由于转基因抗虫棉籽中成分特殊，目前国内尚缺乏检测试剂盒和相关的规范研究。针对以上情况，本研究以10种棉籽为材料，探索出一种快速、简便的提取及纯化棉籽DNA的方法，并将提取纯化的棉籽DNA进行了PCR检测，针对CaMV35S、NOS、NPT和CryA（c）等外源基因和内源基因18S rDNA进行鉴定，为颗粒类产品的外源基因检测提供了可行方法1-6。现将该方法及其研究情况总结如下，以供参考。 1材料与方法 1.1试验材料 供试样品棉籽为太谷县种子销售点采样，取10个品种，分别为晋棉26、中棉所38、中棉所41、中棉所42、晋棉7号、晋棉12、晋棉37、晋棉38、永丰棉5号和永丰棉998。阳性棉籽（转基因）、阴性棉籽（非转基因）均由国家农业部提供。取混合均匀的样品棉籽各50 g，分别在超静台中用液氮进行研磨处理，制备成棉籽粉备用。 1.2棉籽DNA的提取纯化（CTAB法） 将200 mg经预处理的试样，加入400 L冰上预冷的CTAB提取缓冲液中（不需研磨的试样直接加入）。加入500 L 65 预热的CTAB提取缓冲液及1 L 2-巯基乙醇，混匀，以65 保温3090 min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷却至室温后加入5 L RNase A贮液，室温下放置30 min。加入450 L氯仿+异戊醇，轻缓颠倒混匀溶液。以12 000 r/min离心2 min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，依次加入600 L异丙醇及60 L乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。再以12 000 r/min离心10 min。弃上清液，加入800 L 76%乙醇，12 000 r/min离心5 min，弃上清液后，再加入100 L 70%乙醇洗涤沉淀。以12 000 r/min离心5 min，弃上清液。除去残留的乙醇，待沉淀干燥后，DNA沉淀溶解于100 L TE缓冲液中，-20 保存备用。 1.3PCR反应条件 从10份棉籽粉中分别提取DNA，电泳后进行PCR扩增。18S rDNA、CaMV35S、NOS和NPT引物反应条件：95 10 min，（94 30 s，54 40 s，72 1 min）40个循环，72 10 min。CryA（c）引物反应条件：95 10 min，（94 30 s，60 40 s，72 1 min）40个循环，72 10 min。PCR反应体系为25 L7-8。PCR反应后，取7 L PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析。 2结果与分析 2.1棉籽DNA提取电泳结果 由于棉籽成分特殊，目前国内尚缺乏检测试剂盒和相关的规范研究。本研究经过反复试验，开发出离心柱法提取棉籽DNA的方法，已从200 mg中提取出0.4 g DNA（核酸蛋白浓度检测仪检测），将获得的溶液取7 L进行琼脂糖凝胶电泳（图1）。 2.2不同品种的棉籽粉扩增结果 从10份棉籽粉中分别提取DNA，电泳后进行PCR扩增。结果表明，在10个品种中，除用内源基因扩增均呈阳性外，其余4个引物扩增均呈阳性的有8个品种，分别为：晋棉26、中棉所38、中棉所41、中棉所42、晋棉37、晋棉38、永丰棉5号、永丰棉998；晋棉12和晋棉7号的其余4个引物扩增均呈阴性（表1）。目前，转基因棉籽较多，而棉籽中转基因成分含量的测定有待进一步研究。 3结论与讨论 通过试验建立了一种快速、简便的检测棉籽转基因成分的方法，该方法能从200 mg棉籽粉中提取0.4 g高纯度DNA，从而用于PCR检测；在提取底层沉淀时适当延长了离心时间。试验结果显示，增加离心时间有利于DNA量的提取；经过10种棉籽DNA提取，针对18S rDNA、CaMV35S、NOS、NPT和CryA（c）基因进行了PCR检测，分别扩增出不同的目的片段。以上检测方法可用于其他油脂类产品的检测。 在PCR检测中，样品DNA的数量和纯度是检测成功的关键。本研究选用CTAB法直接从组织中提取DNA进行纯化，得到高品质的DNA。该方法同时适用于其他植物类产品的提取。目前国内外罕有成功从棉籽产品中提取DNA且进行该产品转基因成分检测的报道，后续研究可以从以下几个方面进行：一是进一步优化条件，以便得到更加稳定、纯度高的DNA，同时开发研制试剂盒。二是PCR产物的酶切鉴定。以本文研究结果为基础，将棉籽的PCR产物回收，进行PCR产物的酶切鉴定。三是PCR产物的克隆和测序。对PCR产物片段按PCR产物回收试剂盒说明进行琼脂糖凝胶回收，连接到T-easy载体上进行序列测定，并对序列结果进行比对和分析。 4 _ 1 上官小霞，李燕娥，梁运生，等.GUS基因和NPT基因表达的相关性及其在转基因棉花检测研究中的应用J.棉花学报，xx，19（3）：163-167. 2 盛承发，王少丽，宣维健，等.抗虫杂交棉研究与应用进展J.农业现代化研究，xx，23（5）：347-351. 3 王彦霞，吴立柱，王省芬，等.含NPT标记基因的转基因抗虫棉室内快速鉴定方法J.棉花学报，xx，19（2）：134-138. 4 周晓梅，沈晋良.棉铃虫对转CryAc基因棉的抗性遗传及AFLP标记研究J.棉花学报，xx，17（5）：269-274.