生物化学研究技术-3SDS-PAGE鉴定菠萝蛋白酶的纯度

SDS-PAGE鉴定菠萝蛋白酶的纯度,一、实验目的,1、学习和掌握电泳（SDS-PAGE）的基本原理及电泳技术。2、熟练配制SDS-PAGE相关各种试剂。,二、实验原理,电泳:带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。,影响电泳的主要因素,（1）颗粒性质：一般说来，颗粒带净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就快。反之，则越慢。（2）电场强度：电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。（3）pH值（4）离子强度：溶液的离子强度一般在0.020.2mol/kg之间电泳较合适。（5）溶液粘度（6）电渗（7）焦耳热（8）筛孔,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的一种电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体(简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，在催化剂的作用下聚合而成的。,聚丙烯酰胺凝胶聚合的体系有两种，即化学聚合和光聚合。化学聚合的引发剂是过硫酸铵(NH4)2S2O3(简称Ap)，催化剂是N，N，N，N-四甲基乙二胺(TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。,聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用T表示。凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C表示。,不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳，带电颗粒在电场中的泳动有电荷效应、分子筛效应还具有浓缩效应。(l)浓缩效应(2)电荷效应(3)分子筛效应,Gel,5%,10%,15%,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,29,45,66,97,200,实验试剂配制,30%凝胶贮液：取30g丙烯酰胺（Acr）、0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis),（先用约50ml蒸馏水溶解，如溶解不了,可加热3050溶解,再用量筒定容至100ml，然后过滤，后置于棕色瓶,4下保存备用）。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套(2)10%过硫酸铵(AP)溶液：取2g过硫酸铵溶解后，用20mldH2O溶解，现配现用。(3)1mol/LHCl500ml：取浓HCl42ml，加蒸馏水至500ml(在通风橱中操作)。(4)分离胶缓冲溶液（1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8）:取18.15gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液约48ml，调pH至8.8,定容至100ml。,(5)浓缩胶缓冲液(0.5mol/LTris-HCl缓冲液,pH6.8):取6gTris溶解后，加1mol/LHCl溶液40ml，调pH至6.8，定容至100ml。(6)10%SDS(十二烷基硫酸钠)溶液:取5gSDS加水定容至50ml。（加热溶解）(7)2电极缓冲液(0.1%SDS0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3):取6gTris，28.8g甘氨酸和1gSDS加水溶解后，定容至000ml（配好的溶液pH8.3）(12个组可配2升,使用时再稀释2倍)。,(8)样品溶解液：取SDSg，-巯基乙醇ml，甘油10ml，溴酚蓝0.1g，0.5mol/LpH6.8TrisHCl缓冲液(浓缩胶缓冲液)10ml，加蒸馏水25ml，(最后的总体积为50ml),装于棕色瓶。(9)染色液（0.1%考马斯亮蓝-45%甲醇-10%冰乙酸溶液）：1g考马斯亮蓝R250，加入450ml甲醇、100ml冰乙酸，用水定容至1000ml。(12个组可配2000ml)(10)脱色液高甲醇1000ml：甲醇454ml，冰醋酸75ml，dH2O471ml低甲醇1000ml：甲醇50ml，冰醋酸75ml，dH2O875ml,七实验步骤1.清洗并吹干玻璃板。2.在塑料胶条的两面涂少量凡士林（注意不能涂多，以防弄脏玻璃板）。3.把玻璃板放入电泳槽中。4.用小烧杯加6ml蒸馏水，2ml30%凝胶储液，20ulTEMED，100ul10过硫酸铵，混匀，迅速倒入封口槽处(一定要快！)，静置约10min直到凝固。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套5.加dH2O于两层玻璃之间，检查玻璃底是否漏水；如果漏水，要重装。,6.按下表用小烧杯配12%分离胶，混匀，灌胶，高度离梳子约11.5cm，然后覆盖一层水，凝胶时间为1530min，胶与水分层，倾倒去水。,7.凝好胶，垂直拔掉梳子（不要左右摇梳子）。8.上槽加入电泳缓冲液（电极缓冲液稀释2倍），液面需没过低玻璃板；下槽电泳缓冲液没过玻璃板封胶处1cm。9.用1.5mlep管取100l粗酶样品与100l样品溶解液混合均匀，与蛋白质分子量标准一起置于沸水浴5min）。,10.微量注射器按下表2点样，隔孔点样，注意不要交叉污染（每点一个样都要清洗微量注射器）。表2点样方式,*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔,11.上槽接负极，下槽接正极。12.恒电流电泳：浓缩胶，1012mA，待溴酚蓝迁移到浓缩胶与分离胶的界面调整电流至20mA。13.待溴酚蓝迁移到距分离胶底部0.51cm处，结束电泳。14.染色（2030min），回收染色液。15.脱色：高甲醇6080ml，25min；高甲醇4060ml20min；低甲醇80100ml完全脱净,剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分,16.拍照并画电泳图谱，计算标准蛋白、待测样品的相对迁移率（蛋白相对迁移率蛋白迁移距离/指示剂迁移距离）。17.用低分子量标准蛋白质所作的标准曲线，求待测样品亚基的相对分子量。18.以标准蛋白质电泳的相对迁移率为横坐标(X)，标准蛋白质分子量的对数为纵坐标(Y)，绘标准蛋白质的标准曲线，再根据样品相对迁移率在曲线上求出其蛋白质的分子量。,低分子量标准蛋白质的组分：1)兔磷酸化酶B分子量97,4002)牛血清白蛋白分子量66,2003)兔肌动蛋白分子量43,0004)牛碳酸酐酶分子量31,0005)牛蛋白酶抑制剂分子量20,1006)鸡蛋清溶菌酶分子量14,400,八实验注意事项1.缓冲液的pH值、浓度要准确配置；2.AP新鲜配置。3.SDS在低温下析出，使用前水浴加热使之溶解。,九实验结果分析,1.各实验组分析讨论实验结果，再由老师进行归纳总结。2.做好电泳图谱的绘制及数据记录。3.学生对该实验有哪些体会。,4.思