[英语]第三章-荧光分析PPT课件

-,1,第二节,影响分子荧光的因素,-,2,1.荧光效率f,Or:,f表示分子产生荧光的能力。,-,3,荧光效率与激发态能量释放过程的速率常数有关:,-,4,-,5,分子产生荧光的条件：,1.对紫外可见光有强吸收。(分子结构)2.分子去激发时，无辐射跃迁几率小，辐射跃迁几率大。（化学环境）,-,6,2.分子结构与荧光,(1)跃迁类型：,*和*n,*比*n跃迁的荧光效率高,-,7,原因：,1.*跃迁比n*跃迁的max大102103倍。,2.*跃迁的寿命（10-710-9s）比*n跃迁的寿命（10-510-7s）短。,3.*跃迁的能量差比*n跃迁的能量差大（E*E*n）。,-,8,(2)共轭效应,分子的共轭效应越强，荧光效率越高，荧光发射波长越大。,-,9,(3)分子刚性共平面结构,共平面：分子结构处于一个平面上。平面结构的分子比非平面的分子荧光效率高,刚性：分子刚性越强，荧光效率越高,-,10,1，2-二苯乙烯（顺式，非平面）无荧光,1，2-二苯乙烯（反式，平面）强荧光,-,11,-,12,刚性分子：物质分子共平面大，使分子振动减小的分子。,f=0.2,f=1.0,联二苯,芴,-,13,使分子共平面增大的方法：,引入某些基团、氧环形成封闭环通过有机化合物与金属离子形成配合物,-,14,酚酞,荧光素,f=0,f=0.92,-,15,Mg,8-羟基喹啉,8-羟基喹啉镁,弱荧光,强荧光,-,16,分子的刚性共平面使荧光效率增大：,分子共平面越大，共轭程度越高。分子共平面越大，刚性越强，振动越小，与其他分子发生碰撞造成无辐射跃迁几率减小。,-,17,（4）取代基效应（芳香环）,给电子基-NH2、-OH、-OR吸电子基-COOH、-NO2、-NO某些重原子（卤族Br或I），引起体系间跨越,使f,使f,使f,重原子效应,-,18,-,19,3.化学环境与荧光,（1）温度,温度升高，f；温度降低，f,原因：温度升高，分子间碰撞频率增加，外转移几率增加,因此，在较低温度下测定荧光，有利于提高分析的灵敏度。,-,20,（2）溶剂效应,增大溶剂极性，f增大，荧光波长向长波长方向移动。含重原子的溶剂（如CBr4和C2H5I），引起体系间跨越，物质f减弱。与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子f减弱,重原子效应,极性增大,喹啉在不同溶剂中的相对荧光强度,-,21,（3）pH,对酸碱化合物，溶液pH影响较大：,pH13,pH712,无荧光,蓝色荧光,无荧光,-,22,无荧光,有荧光,-萘酚：,-,23,（4）荧光熄灭剂,荧光熄灭：荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用，引起荧光强度下降或消失的现象。,荧光熄灭剂：能够引起荧光强度降低或消失的物质。,-,24,常见荧光熄灭剂：,卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等。,发生碰撞而使之失去能量生成不发光的化合物溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三重态,荧光自灭：荧光物质浓度增大时，荧光强度减弱,-,25,第三节,荧光光度计及荧光测量,-,26,荧光光度计：色散元件为干涉滤光片,荧光分光光度计：色散元件为光栅,分类：,-,27,一、基本装置及主要部件功能,光源,单色器,样品池,检测器,单色器,记录仪,ex,I0,It,If,em,Ia,激发单色器,发射单色器,-,28,1.光源,作用：提供稳定、发射强度大的辐射,荧光光度计，以溴钨灯(300700nm)为光源。荧光分光光度计，以氙灯(250600nm)为光源。,常见光源：,-,29,2.单色器,滤光片荧光光度计光栅荧光分光光度计,荧光分光光度计,激发单色器:置于样品池前，得到单色性好的激发光（ex，I0）,发射单色器:置于样品池后，从荧光光谱中分离出某一波长的荧光（em，If）,色散元件,-,30,3.样品池,4.检测器,5.读出装置,以石英为材料，四面均为透光面。,光电管荧光光度计光电倍增管荧光分光光度计二极管阵列及电荷转移检测器高档荧光分光光度计,记录仪阴极示波器显示器,光源,单色器,样品池,检测器,单色器,记录仪,It,If,2荧光光度计与紫外可见分光光度计区别：（1）两个单色器，分别在样品池前后：激发单色器（第一单色器）、发射单色器（第二单色器）（2）样品池：紫外可见光被吸收（池）、荧光发射（池）（3）激发光源（入射光）与荧光检测器相互垂直放置。可避免入射光或透过光对微弱荧光的干扰。,-,33,二、激发光谱、荧光发射光谱,激发光谱：固定荧光发射波长(em)，改变激发波长（ex），以激发波长为横坐标、荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。,荧光发射光谱：固定激发波长(ex)，改变发射波长（em），以发射波长为横坐标，荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。,-,34,特点：,If,400,300,500,发射光谱形状与激发波长无关,a,b,/nm,硫酸喹啉的激发光谱和荧光发射光谱,-,35,200,250,300,350,400,450,500,荧光激发光谱,荧光发射光谱,蒽的激发光谱和荧光发射光谱,/nm,If,a,b,c,发射光谱与激发光谱呈镜像对称关系,-,36,三、荧光定量分析基本原理,1.荧光强度与溶液浓度的关系,It,If,Ia,If=fIa=f(I0It),It=I010-A,If=fI0(1-10-A)=fI0(1-e-2.3A),-,37,若A0.001gmL-1蒽:05gmL-1,-,48,2.间接法,利用化学反应使一些不能产生荧光的化合物转变成荧光物质；或将芳香族化合物与适当荧光试剂反应，生成强荧光物质，可提高方法的灵敏度，,方法：增大分子共轭体系或增加刚性,-,49,常用的化学反应方法,1）氧化还原反应,-,50,2）水解反应,-,51,3）与荧光试剂反应,磺胺类药物与荧光试剂邻苯二甲醛缩合反应，生成荧光化合物。,-,52,含氨基的药物与荧光试剂丹酰氯（DANS-Cl）反应，生成荧光化合物。,DNAS-Cl,DNAS-NHR,-,53,三、分析条件的选择,1.仪器校正,（1）波长,荧光光度计长期使用，或更换检测器等重要部件，可用汞灯标准谱线对单色器波长进行校正。,-,54,（2）灵敏度,在选定波长及狭缝宽度的条件下，用某种稳定的荧光物质配成标准溶液进行校正。若被测物质的荧光很稳定，也可用作标准溶液对仪器的灵敏度进行校正。,-,55,2.激发波长,绘制荧光激发光谱，选择能产生最强荧光的激发波长（ex），即最大激发波长，作为分析的激发波长。,3.发射波长,绘制荧光发射光谱，选择能产生最强荧光的发射波长（em），即最大发射波长，作为荧光测定波长。,-,56,4.浓度线性范围,分子荧光分析仅适用于稀溶液，溶液的浓度应低于10-6gL-1（A0.05）荧光物质浓度较低时，荧光强度If与物质浓度c成线性关系。在一定条件下，绘制Ifc标准曲线确定浓度线性范围，以减小测量误差。,-,57,本章小结,-,58,一、分子荧光基本原理,物质受到光照射时，吸收某种波长的光之后还会发射出比原来所吸收光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。,基态,激发态,hv,hvf,激发,去激发,-,59,-,60,S2,S1,S0,T1,发射荧光,发射磷光,体系间跨越,内转换,振动弛豫,能量,l2,l1,l3,外转换,l2,T2,-,61,去激发的方式：,产生荧光,产生磷光,外传移，放出热量,-,62,二、影响分子荧光的因素,1.荧光效率f（荧光量子产率）,或,f还可表示如下：,（1）凡是使分子荧光发射几率增大的因素，都会使分子的f，If。（2）凡是使外传移（碰撞）几率增大、使分子磷光发射（体系间跨越）几率增大的因素，都会使分子的f，If。,2.化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：*的荧光效率高，体系间跨越的速率常数小，有利于荧光产生。（2）共轭效应：提高共轭程度有利于增加荧光效率并产生红移。（3）刚性共平面结构：增大分子共轭程度，降低分子振动，故增加荧光效率。,-,66,（4）取代基效应：芳环上有给电子基，使荧光增强吸电子基，使荧光强度减弱重原子（Br和I）引起体系间跨越，使荧光强度减弱。,3.影响分子荧光的外部因素,（1）温度：温度越高，荧光效率越低，温度越低，荧光效率越高。（2）溶剂效应：溶剂极性越大，分子荧光效率越高；含重原子的溶剂导致体系间跨越，分子荧光效率下降；与荧光分子形成氢键的溶剂，使分子荧光效率下降。,（3）pH值：荧光物质为弱酸弱碱，酸度的改变会导致荧光物质分子结构改变，使荧光效率改变。,（4）荧光熄灭剂：荧光熄灭剂的存在会引起荧光分子荧光强度减弱或消失。,发生碰撞而使之失去能量生成不发光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三重态。,-,69,三、激发光谱和荧光发射光谱,激发光谱：固定荧光发射波长(em)，改变激发波长（吸收波长，ex），以激发波长为横坐标、荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。,荧光发射光谱：固定激发光波长(ex)，改变荧光发射波长（em），以荧光发射波长为横坐标、荧光强度（If）为纵坐标绘制关系曲线。,-,70,荧光发射光谱的特点：,荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱与激发光谱成镜像关系,-,71,三、荧光定量分析基础,四、荧光光度计及荧光测量1荧光光度计的主要部件：（1）激发光源：紫外可见连续光源，如氙灯（Xe）、溴钨灯。（2）激发单色器：A或ex，激发（吸收）光谱；（3）样品池：既是吸收池又是荧光发射池；（4）荧光发射单色器：f或em，荧光发射光谱；（5）检测器：将微弱荧光信号，转变成电信号；（6）放大、显示系统：,2荧光光度计与紫外可见分光光度计的结构区别：（1）两个单色器，分别在样品池前后：激发单色器（第一单色器）、荧光发射单色器（第二单色器）（2）样品池：紫外可见光被吸收（池）、荧光发射（池）（3）激发光源（入射光）与荧光检测器必须相互垂直放置。主要是为了避免入射光或透过光对微弱荧光测量的干扰。,三、分子荧光定量分析方法1标准比较法：设Ifs、Ifx、If0由公式If=kc,2标准曲线法：制作IfCs工作曲线，由Ifx求Cx,