蛋白质一级结构测定ppt课件

.,第三章蛋白质的一级结构的测定,.,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,.,蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作,.,A.样品必需纯（97%以上）；B.知道蛋白质的分子量；C.知道蛋白质由几个亚基组成；D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,（1）测定蛋白质的一级结构的要求,.,（2）蛋白质分子的一级结构测定方法,氨基酸组成分析,氨基酸末端分析,蛋白质中肽链的拆离,肽链的部分降解及肽片断的分离,肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠,二硫键与酰胺基的定位,.,测定蛋白质氨基酸残基组成,根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量；,采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。,.,测定蛋白质分子中多肽链的数目,通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,.,由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来；几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基；用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。,二硫健的断裂及多肽链的拆分,.,巯基的保护,用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化,.,用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定；测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反应分析各肽段氨基酸顺序；,多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定,.,获得的各肽段的氨基酸顺序彼此间的交替重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序；确定多肽链中二硫键的位置。,利用酶选择性降解和溴化氰选择性降解,.,2、多肽链氨基酸顺序分析,多肽链降解必须满足两个条件：选择性强、反应产率高主要方法包括酶解法和化学法,.,某些蛋白水解酶能够选择性的水解多肽链中的某一类肽键；主要有胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶；糜蛋白酶（chymotrypsin):苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸；胃蛋白酶（pepsin)：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、以及其他疏水性强,酶解法,.,特点：专一性较强，水解速度快断裂位点：赖氨酸或精氨酸残基的羧基参与形成的肽键R1=Lys（赖、K）和Arg（精、R）R2=Pro（抑制）,胰蛋白酶（trypsin）,.,特点：专一性稍弱，Leu、Met和His稍慢断裂位点：Phe（苯丙）、Trp（色）、Tyr（酪）等疏水氨基酸残基的羧基端肽键R1=Phe（F）、Trp（W）Tyr（Y）等疏水性AAR2=Pro（抑制）,糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）,水解速度与相邻AA性质有关:酸性：-/碱性：+,.,特点专一性与糜蛋白酶相似，较弱；断裂位点：两侧的残基都是疏水性氨基酸R1和/或R2Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）及其它疏水性AA水解速度较快R1=Pro（抑制）pH2.0,肽链,水解位点,胃蛋白酶Pepsin,.,特点：专一性较差断裂位点：Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr、Met等疏水性强氨基酸残基的羧基端肽键R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性强的AA水解速度较快,嗜热菌蛋白酶（thermolysin),.,木瓜蛋白酶：专一性差断裂位点：对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏感葡萄球菌蛋白酶：高专一性断裂位点：Glu和Asp残基的羧基端肽键磷酸缓冲液Glu残基的羧基端肽键碳酸氢铵、醋酸铵缓冲液）,梭菌蛋白酶：高专一性断裂位点：Arg残基的羧基端肽键,.,溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,化学法,.,-选择性地切割由Met羧基形成的肽键,溴化氰水解法(Cyanogenbromide),.,N末端的测定二硝基氟苯法（DNFB法）；二甲氨基萘磺酰氯法(DNS-CL法）；异硫氰酸苯脂法（PITC法）；C末端的测定羧肽酶法；硼氢化锂法；肼解法,（2）多肽链的末端氨基酸测定,.,N末端测定方法比较C末端更加成熟、可靠和准确，主要的方法有：二硝基氟苯法（DNFB法）肽链N末端氨基与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应，生成二硝基苯的衍生物（DNP-肽），其经酸水解后生成的DNP-氨基酸可用有机溶剂（如乙酸乙酯）抽提，再与其他氨基酸分开，鉴定得知N末端的氨基酸。,N末端的测定,.,二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法。,.,荧光剂二甲氨基萘磺酰氯（dansyl-chloride,DNS-Cl）可以作为标记试剂专一地与肽链N末端氨基反应生成DNS-肽；同样，酸水解后可得DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定；DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈的荧光，根据荧光点的位置，确定N末端的氨基酸。此方法反应原理同DNFB法，但其灵敏度比DNFB法高约100倍，用于层析分析的样品只需1nmol。,二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）,.,.,基本原理：偶联-环化-转化,异硫氰酸苯酯能与N末端氨基偶联生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽）,异硫氰酸苯酯法（PITC法）,.,在酸性溶液中，PTC-肽经环化裂解生成PTC-氨基酸和N末端少一个氨基酸的剩余多肽，前者可用于N末端氨基酸鉴定，但是该产物不稳定，很快进一步转化成3-苯基-2-乙内酰硫脲-氨基酸（PTH-氨基酸）。,.,生成的PTH-氨基酸非常稳定，它在268nm处有强吸收峰。剩余多肽链的N末端仍是自由的，可以进一步与异硫氰酸苯酯反应进行第二步降解。这样就可以从N末端开始逐次降解下去，进行顺序测定。该方法也称Edman顺序降解，它是制造氨基酸顺序分析仪的理论基础。,.,一般说来，C末端测定较N末端分析的误差大。可采用的方法有：1羧肽酶法：羧肽酶能特异地水解C末端氨基酸形成的肽链，而用于测定C末端氨基酸。羧肽酶分A、B、C、Y4种，羧肽酶A使用最多，但对C末端的Pro、Arg、Lys及Hyp不起作用。羧肽酶B，只释放C末端的Lys和Arg，可以和羧肽酶A互补使用。羧肽酶C的作用范围宽。但对C末端的Hyp或连续几个甘氨酸（-Gly-Gly-Gly）无作用。羧肽酶Y也具很宽的作用范围。2硼氢化锂法（LiBH4法，也称“还原法”）：硼氢化锂可以与C末端氨基反应生成相应的-氨基醇，水解后抽