《凯氏法蛋白质测定》PPT课件

第十一讲食品蛋白质及氨基酸的测定,1.蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。,第一节概述,食品中蛋白质的含量,第一节概述,测定蛋白质最基本的方法是通过先测定样品中的总氮量，再由总氮量计算出样品中的蛋白质含量。食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量和杜马法。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。,第一节概述,一些蛋白质的含氮量,第一节概述,一些蛋白质的含氮量一般为15%17.6%，有的上下浮动可以测出总氮N,=N6.25=蛋白质含量,第一节概述,2.蛋白质定量法,利用蛋白质共性的方法,定氮法双缩脲法物理法,利用特定氨基酸残基法,染料结合法福林酚试剂法,凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍。,第一节概述,一、凯氏定氮法,由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化(digest)，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。而样品中的有机氮(organicnitrogen)转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。,第二节蛋白质的测定,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定（1）消化总反应式：,加硫酸钾作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。,第二节蛋白质的测定,加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。,第二节蛋白质的测定,消化装置“自动回流消化仪”,第二节蛋白质的测定,（2）蒸馏消化完全的样品溶液，浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气(NH4)2SO4+2NaOHNH3+Na2SO4+2H2O,第二节蛋白质的测定,(3）吸收与滴定(titration)吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液滴定：盐酸标准溶液，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.810-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用也可采用硫酸或盐酸标准溶液吸收，然后再用氢氧化钠标准溶液反滴定吸收液中过剩的硫酸或盐酸，从而计算总氮量,第二节蛋白质的测定,2、适用范围（application)此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定。3、试剂浓硫酸：脱水、氧化硫酸铜：催化剂及消化指示剂硫酸钾：提高溶液的沸点氢氧化钠混合指示剂硼酸盐酸,第二节蛋白质的测定,4、操作方法（1）消化：固体样品0.2-2g，半固体样品2-5g，液体样品10-20ml，加入催化剂及浓硫酸进行消化至溶液绿色透明。（同时做空白实验）（2）蒸馏：按装置进行连接，奈氏试剂检查，无红棕色物质生成(检查氨是否全部蒸完)，蒸馏过程中用硼酸吸收。（3）滴定用0.1000mol/L盐酸滴定至由兰色变为微红色。（甲基红为指示剂）,第二节蛋白质的测定,5.蛋白质计算(V1V0)C0.014F100蛋白质=mnV1V0滴定时所耗盐酸标准溶液的毫升数；C标准盐酸溶液的当量浓度；0.141毫升当量氮的克数；F氮的蛋白质换算系数；m样品克数。n稀释倍数,第二节蛋白质的测定,6.注意事项当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢23m1后再继续加热消化。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。,第二节蛋白质的测定,二、微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量有50ml10ml,滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。3、蒸馏装置,第二节蛋白质的测定,第二节蛋白质的测定,三、自动凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。,第二节蛋白质的测定,第二节蛋白质的测定,四、双缩脲法,传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、水杨酸比色法等。都是快速测定蛋白质的方法,第二节蛋白质的测定,1、原理当脲（尿素NH2CONH2）加热至150160时，可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲（也叫双缩脲），反应式如下：,第二节蛋白质的测定,双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物，此反应称为双缩脲反应,第二节蛋白质的测定,蛋白质分子含有肽键,与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。,第二节蛋白质的测定,2.方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定3.主要仪器：分光光度计，离心机（4000r/min）4.试剂：(1)碱性硫酸铜溶液(2)四氯化碳,第二节蛋白质的测定,5操作方法：标准曲线的绘制采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。显色（加入试剂静置1小时）比色（取上清离心）样品的测定显色比色查标准曲线,第二节蛋白质的测定,6、结果计算蛋白质（mg/100g）=式中：c由标准曲线上查得的蛋白质mg数；m样品质量，g,第二节蛋白质的测定,7、说明及注意事项蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大，有大量脂肪存在时，会出现混浊可以先脱脂标准曲线作完整后，无需每次再作标准曲线样品含有脯氨酸且有大量糖类存在时，显色不好还会出现结果偏低。,第二节蛋白质的测定,五、紫外吸收法,1原理：利用蛋白质的特有基团，对紫外光有吸收作用在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。,第二节蛋白质的测定,2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3主要仪器：紫外分光光度计离心机（30005000r/min）4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线,第二节蛋白质的测定,第三节挥发性盐基氮的测定,挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，用标准酸滴定计算含量。1.原理挥发性盐基氮遇到弱碱氧化镁游离蒸馏出来，蒸馏出来的氨，被硼酸吸收后生成硼酸铵，使吸收液变为碱性，混合指示剂由紫色变为绿色。再由标准盐酸滴定至紫色。,2、试剂2.1氧化镁混悬液（10g/L）：称取1.0g氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液。2.2硼酸吸收液（20g/L）。2.3盐酸c(HCL)=0.01mol/L或硫酸c(1/2H2SO4)=0.01mol/L的标准滴定溶液。2.4甲基红乙醇指示剂（2g/L）。2.5次甲基蓝指示剂（1g/L）。,3.分析步骤样品处理：精确取10g试样（粉碎好的样品）于200mL磨口三角瓶中，加100.0mL(V总)蒸馏水于振荡器上振荡30分钟，4000转离心。蒸馏滴定：将盛有20.0mL吸收液及5-6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，准确吸取10.0mL（V分取）上述样品上清液于蒸馏器反应室内，加10mL氧化镁混悬液（10g/L），迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏5min即停止，吸收滴定：吸收液用盐酸标准滴定溶液0.01mol/L）或硫酸标准滴定溶液滴定，终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。,4.计算式及结果表述：(V1-V0)c14X=100m（5/100）,第四节氨基酸定量测定,一、甲醛滴定法1、原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸总量。,2、方法特点及应用此法简单易行、快速方便。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。,3、试剂,40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。0.1%百里酚酞乙醇溶液0.1mol/L氢氧化钠标准溶液,4、操作方法样品溶液（氨基酸约20-30mg），+50ml蒸馏水加入3滴百里酚酞指示剂+中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定（淡兰色，终点）记录所消耗的碱液ml数。,5、结果计算X（V2VI）C0.014100V式中：X为样品中氨基氮含量（g100g）；V2-百里酚酞作指示剂时消耗氢氧化钠标准液的体积（ml）；V1-空白液消耗氢氧化钠标准液的体积（ml）；C-氢氧化钠标准液的浓度（molL）；V-为样品液取用量（ml）0.014-为氮的毫摩尔质量（g/mmol）,6、说明及注意事项此法适用于测定食品中的游离氨基酸。固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在500C水浴中进行0.5小时即可。若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和-COOH基时的pH为8.5-9.5，但分析结果稍偏低，双指示剂法的结果更准确。,误差脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高；溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高。,二、电位滴定法,1、原理根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH值判断和控制滴定终点。,2、仪器酸度计、磁力搅拌器、微量滴定管3、试剂20%中性甲醛溶液：参考甲醛滴定法试剂0.05mol/L氢氧化钠标准溶液4、操作方法pH8.2-计算总酸含量；pH9.2-试剂空白试验。,5、结果计算X=（V1V2）C0.014100V式中：X为样品中氨基酸的含量（g/l00ml）；V1-测定用样品加人甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液的体积（ml）；V2-试剂空白试验加人甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；V-样品稀释液取用量（ml）；C-氢氧化钠标准液的浓度（mol/L）0.014-氮的毫摩尔质量（g/mmol）。,6、说明本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定对于浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。,三、其他方法,1.茚三酮比色法(ninhydrinmethod)原理氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色(Ruhemannpurplecolor)化合物（除脯氨酸外均有此反应）。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测定样品中氨基酸含量。,2.薄层