《刘宝DNA甲基化》PPT课件

表观遗传学创新实验5-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化的影响,庞劲松刘宝,东北师范大学生物基础实验教学中心,表观遗传学与DNA甲基化DNA甲基化作用DNA的甲基化及其方式DNA甲基化的生物学意义DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成DNA胞嘧啶甲基化检测检测方法：MSAP，bisulfitesequencing5氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响实验目的实验材料仪器试剂实验方法5-氮胞苷处理水稻幼苗植物基因组DNA的提取与纯化基因组DNA酶切-连接接头PCR扩增：预扩增，选择性扩增PAGE电泳预期实验结果注意事项与建议思考题参考文献,表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括:X染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。,DNA甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化,DAM(DNA腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列GATC,在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸),在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化,DNA甲基化作用,图1胞嘧啶甲基化过程,图2腺嘌呤甲基化过程,DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录图3甲基化与基因沉默参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型,DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成从头甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。维持甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化状态给新合成的DNA链上加上甲基。,图4两种胞嘧啶甲基化方式,DNA胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等,MSAP用途：最常用的大规模检测基因组甲基化变异水平和位点的手段原理：利用对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶分别切割DNA，产生不同的酶切产物，同时将酶切产物添加接头，然后进行PCR扩增、PAGE电泳、银染，产生可见的具有不同酶切型式的谱带，即可得知DNA甲基化信息。甲基化状态分析：在不同泳道相对应的位置上，如果MspI酶切产物有扩增带、而HpaII酶切产物没有扩增带的，说明此处的序列是CCmGG；若都有扩增带，说明此处是CCGG。还可以进一步对差异条带进行切胶回收、克隆、测序，以便得知发生甲基化变化的胞嘧啶的具体位置。表1甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果,MSAP流程：提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同）ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGMspI酶切+接头HapII酶切+接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGACATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGTAGGCCACCGAACGGCCTGPCRPCRPAGE电泳PAGE电泳,MspI5CC(m)GG33GGC(m)C5,HpaII5CCGG33GGCC3,重亚硫酸盐测序,图5重亚硫酸盐测序原理,5氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响,实验目的使用不同浓度的5氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。实验材料水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)5氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平：5氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。,所需仪器,离心机PCR仪气浴摇床水浴摇床植物生长箱电泳仪电泳槽微量移液器紫外分析仪分析天平,图6所需主要仪器,试剂植物基因组DNA改良CTAB提取液：bufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LEDTA;bufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;bufferC:5%N-lauroylsarcosinePCR试剂：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，PCR引物预扩增引物：H/M+0:(5-GACTGCGTACCAATTCA-3)EcoRI+0:(5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3)选择性扩增引物：H/M+AN:5-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3EcoRI+AN:5-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3。酶切-连接试剂：EcoRI(NEB)，HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410 xreactionbuffer接头：EcoRIadapter:5-CTCGTAGACTGCGTACC-3CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspIadapter:5-GATCATGAGTCCTGCT-3AGTACTCAGGACGAGCPAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝，银染固定/终止液(10%冰乙酸)，染色液(2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml37%甲醛)，显影液(2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12C，用时，加入3ml37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。其它试剂：5-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP(20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A(DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的DNA，1xTBE(0.089MTris-borate,0.089MBoricAcid,0.002MEDTA)，3xloadingbuffer(300mMNaOH,97%formamide,0.2%bromophenolblue)。,实验方法,5-氮胞苷处理水稻幼苗：26，暗培养(1)取水稻Nipponbare种子10粒X4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）(2)分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL,50mg/mL,100mg/mL5-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二十一天）,图75-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）,植物基因组DNA的提取与纯化改良CTAB法(KidwellandOsborn,1992)不同处理的叶片1g液氮中研磨成粉转入50ml离心管加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)65恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟43000rpm离心10-15分钟上层水相加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4冰箱内10minDNA沉淀后于43000rpm离心收集DNA于管底DNA于70%乙醇中过夜。DNA沉淀（第十二天）,风干DNAGenomicDNA2mlEppendorf中加1mlTE溶解沉淀待DNA完全溶解后，加入5l不含DNA酶的RNA酶，37保温30分钟以除去DNA中的RNA。加入等量氯仿:异戊醇(24:1)纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟43000rpm离心10-15分钟DNA沉淀70%乙醇过夜洗涤DNA溶于DNA于200-500lTE中GenomicDNA溶液0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNAMarker（未酶切的DNA）估计其浓度。调整DNA浓度，置於-20备用。,基因组DNA酶切-连接接头甲基化分析采用两种甲基化敏感酶Hap和Msp（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100变性5分钟,缓慢冷却至室温，-20冷冻保存备用。水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：,混匀体系，37，6小时，8，4小时，4保存。共四个处理组，即Nipponbare25mg/mL处理组，Nipponbare50mg/mL处理组，Nipponbare100mg/mL处理组，Nipponbare对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切8管（第十五天）,表2水稻MSAP限制性酶切、连接体系,PCR扩增预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：PCR程序：94预变性2min,94变性30秒，56复性30秒，72延伸60秒,共进行30个循环，最后72延伸10分钟。根据检测结果，用0.1xTEbuffer稀释预扩增产物1/101/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。,表3AFLP预扩PCR体系,水稻AFLP选择性扩增体系如下：按以下参数进行PCR扩增反应：94预变性2分钟,94变性30秒，65复性30秒，72延伸80秒，以后每轮循环温度递减1，扩增10轮。接着94变性30秒，55复性30秒，72延伸80秒，共进行40个循环，最后72延伸10分钟。（第十七天）,表4AFLP选扩PCR体系,PAGE电泳电泳装置图玻璃板分为大板和小板(上部凹形)。自来水清洗95酒精擦两遍硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面5分钟后，95酒精再擦两遍，装板灌胶,图8PAGE电泳系统,尿素-PAGE胶配制灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30L，10%过硫酸铵（APS）160l，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55C。点样前，DNA样品95C变性5分钟，立即冰浴，加3xloadingbuffer,混匀，瞬时离心，点样量16L，恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。,灌胶图电泳图,表5PAGE胶配方,银染操作电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇20分钟，直至指示染料消失。凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起空水15秒。染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起控水凉干备用。（第十九天）,图9PAGE胶银染,预期实验结果同一位置处不同样品电泳条带的不同，显示此处胞嘧啶甲基化状态不同。（第二十天）,图10预期结果PAGE电泳图,注意事项与建议五氮胞苷（5-azacytidine；MW:244.21）：粉末于-20保存，见光或遇热分解，使用时配母液于4保存，保存时间不宜超过半个月；丙烯酰胺为剧毒试剂，配制、使用时必须按有关规程做好个人防护；,思考题,5-氮胞苷为什么能使DNA甲基化水平降低？MSAP的原理是什么？如何分析MSAP电泳图？,参考文献,1RazinA,CedarH.DNAmethylation-BiochemistryandBiologicalSignificance.JChromatogr,1992,581(1):31-40.2F