《型液相色谱简介》PPT课件

仪器分析课程讲义,第五节高效液相色谱法的应用,液相制备色谱Preparativeliquidchromatography氨基酸自动分析仪AminoAcidAutoanalyzer,AAA超临界流体色谱Supercriticalfluidchromatograph,SFC,一、液相制备色谱1.概述,细管柱：内径2mm；分析柱：26mm540cm；柱容量有限，采取小量、多次进样能取得ug级的纯组分。半制备柱：8mm20mm1530cm，一次制备量.1mg。制备柱：20500mm50cm，泵流量大、进样量大，可取得10mg至g级纯组分。,制备色谱：以色谱技术来分离、制备较大量纯组分的方法，结构与分析型一样，但采用大流量输液泵、制备柱、柱后馏分收集器（按照固定体积顺序收集组分）。应用：制备标准物；对有机复杂组分进行结构鉴定分析。,2.色谱柱的柱容量（柱负荷）分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰形变宽。超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,3.液相制备色谱方法,欲分离组分呈现一个单峰两个或多个主组分较少的组分是预分离制备化合物,a.欲分离组分呈现一个单峰首先在分析型HPLC上进行试验，优化操作条件以提高分离度，在负载极限内，按比例扩大柱径或使用制备柱，并相应扩大输液泵流量；若还需大量纯物质，可使柱超载运行，中心切割法收集中间馏分,c.两主成分之间的小组分；达到最佳分离度后，利用柱超载，在洗脱区收集要求分离的组分，并将各馏分合并使待分离组分成为主成分（富集），再按照a法对这一富集的试样进行纯化制备。,二、超临界流体色谱Supercriticalfluidchromatograph,SFC,1.概述超临界流体：在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。,超临界流体色谱(SFC)，80年代快速发展，具有液相、气相色谱不具有的优点:1）可处理高沸点、不挥发试样；2）比HPLC有更高的柱效和分离效率,2.超临界流体性质,1、性质介于液体和气体之间;具有气体的低黏度、液体的高密度，扩散系数位于两者之间。2、可通过改变超临界流体的密度（程序升压）调节组分分离（类似于气相色谱的程序升温，液相色谱中的梯度淋洗）。,超临界流体的密度与压力有关。,3.超临界流体色谱仪,3.超临界流体色谱仪,SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3等。SFC的固定相：可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC毛细管柱SFC分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；,压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。压力控制：通过电子压力传感器和流量检测器，由计算机控制，程序地改变流动相的密度和流量。,程序升压,冷冻装置：超临界流体从流体源出来后，经冷冻装置预冷却成液体，再进行压力和温度的平衡，形成超临界流体。检测器：可用气相色谱和液相色谱的检测器，但超临界流体进入检测器之前需转变成为气体或液体。,甘油三酸酯的分析,四种组分仅双键数目和位置不同，难分离色谱柱：DB-225SFC毛细管柱；流动相：CO2；从15MPa程序升压到27MPa2.5hr完全分离。,第六节氨基酸自动分析仪,高速氨基酸分析仪的实质是一台专用的高效液相色谱仪，所用的类型是离子交换色谱法。特点：分析时间缩短；精确度越来越高；完全实现自动化。,一、固定相和流动相,1固定相：强酸性阳离子交换树脂磺酸型SO3Na,氨基酸与树脂的亲和力：碱性氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸,氨基酸自动分析仪出峰次序为：AspThrSerGluProGlyAlaCysValMetIleLeuTyrPheLyeNH3HisArg酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸,在同类型氨基酸中，短碳链的小分子先洗脱下来，长碳链的大分子后洗脱下来。如G1y和Ala，Val和Leu。对碳数相同的氨基酸，有支链的先流出，无支链的后流出。如I1e和1eu。碳链上存在羟基可加速洗脱。如Ser和A1a，Tyr和Phe。,2流动相,Na型：柠檬酸的钠盐标准分析（蛋白质水解产物分析）Li型：柠檬酸的锂盐生理体液（尿、血浆、组织提取液）通过改变缓冲液的PH，离子强度，加有机溶剂可改善部分峰分离。,二、氨基酸分析仪的结构,输液系统进样系统分离系统检测系统记录系统,1输液泵：双泵，分别输送流动相和茚三酮溶液。2进样器3分离柱玻璃管或不锈钢管，柱温：适当改变柱温可以改善某些峰的分离效果。柱长与内径：与固定相颗粒大小有关。,4反应器,氨基酸与茚三酮的反应在100,DYDA（双二酮茚亚胺）最大吸收波长570nm,测定亚氨基酸选用440nm。（Pro）,5检测器,光栅式分光光度器流动池石英两个吸收波长即570nm和440nm荧光检测器荧光剂为荧光胺和邻苯二胺荧光检测器不能测定亚氨基酸。,三、试样处理方法,1.上机分析试液的要求(1)澄清透明(2)无色或略带浅黄色(3)含盐量低，含氨量低(4)无蛋白质或肽类物质(5)pH以22为宜(6)氨基酸合适浓度以氮计为110nm50ul左右。,2.试样的前处理,1）酸处理法一般用6Mol.L-1盐酸溶液，于110水解20-90h,稀释过滤后真空蒸发至干,加0.02mol.L-1盐酸溶解。可得到除色氨酸、胱氨酸外的所有氨基酸。,过甲酸氧化法,在盐酸水解前，先用过甲酸氧化，再进行盐酸水解，胱氨酸与半胱氨酸得到测定，色氨酸和蛋氨酸回收提高。,2）碱水解法,一般用氢氧化铵或氢氧化钠，置入水解管中于110水解20h，水解液用盐酸中和，过滤后上机分析，。保护色氨酸，但其他氨基酸被破坏。,3）酶水解法,蛋白酶具有专一性酶本身是蛋白质，除去困难现只能运用于特定氨基酸的分析。,测定正丁醇的校正因子，以乙醇做内标，称取0.1268g正丁醇和0.1783g乙醇，溶解混匀后，取1uL注入