提取、分离和精制过程中蛋白质活性的稳定性和保存

1,2、提取、分离和精制过程中蛋白质活性的稳定性和保存,2,蛋白质具有一定的不稳定性和脆性。所以长期以来，具有生物活性形式的蛋白质的分离被认为是一项极其困难的工作。,2.1前言,3,2.2蛋白质的三维结构,4,2.3蛋白质的失活,5,当某些氨基酸残基的侧链基团按照它们的顺序形成精确的空间排列时，即可以称为活性位点时，就认为一个特定蛋白质具有某种生物活性。对许多蛋白质而言，这就是其特殊的结合位点。,6,其一，与活性位点有关，参与催化过程或与底物或受体的结合过程。其二，氨基酸残基的准确定位对促进和维持蛋白质三级结构是非常重要的。,蛋白质链中氨基酸残基有两个作用：,7,*蛋白质的变性(denaturation)的本质,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象发生改变或被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失。不涉及一级结构改变或肽键的断裂。,8,蛋白质在各种力和键的相互作用下，多肽链从随机结构折叠成多种多样的具有活性的球状结构，但从熵的角度来讲，随机状态的自由能高于折叠状态，所以蛋白质的结构更倾向于形成较无序和较伸展的随机结构。,“矛盾统一体”,9,引起蛋白质不稳定的原因是伸展过程。从天然的活性状态伸展成较随机（无活性）的状态时，有些蛋白质遵循简单的一级动力学过程，而有些蛋白质则包含着1个或多个相互独立、相对稳定的中间构象状态。因此伸展动力学有时简单，有时复杂，尤其是中间态表现出一定的生物活性的情况下。,隐藏疏水基,表面积增大,疏水基暴露,10,1）温度升高（蛋白质和酶）2）pH值的变化（使蛋白质表面离子化或发生电荷相反的变化，使得折叠构象失去稳定。）3）水溶液中其它溶质（与蛋白质肽链中的N-H和C-O基团发生竞争性抑制）4）溶液中的泡沫（泡沫可增大水-空气界面，导致空气氧化几率增大）5）金属离子有助于蛋白质结构的稳定（蛋白质在折叠过程中使多肽链不同部分的侧链基团形成金属结合位点，当金属离子与之匹配后，可增加蛋白质的整体稳定性。,11,1）固定化：将天然构型蛋白质表面的众多基团与刚性支撑物共价结合，可显著降低蛋白质伸展和失活的概率。2）通过可溶性双功能试剂或底物与蛋白质特定部位共价结合，使其稳定。3）优先水合作用：一些溶质或某些盐存在的情况下可使蛋白质分子内部的疏水性基团不能溶剂化，从而维持天然状态的稳定。,12,目前科学家已从嗜热菌中分离出多种蛋白质，其中包括许多重要的酶类，它们的热稳定性高于中温型细菌的类似蛋白，而且，在细胞内生活状况下这种差别更加明显。也就是说嗜热菌蛋白质的热稳定性取决于两个方面：一方面，其蛋白质的天然结构更加稳定；另一方面，嗜热菌细胞内存在着促进热稳定性的因素。实验证明，蛋白质一级结构中个别氨基酸的改变，就可导致其热稳定性的改变。至于究竟有哪些氨基酸改变，还有待科学家的进一步研究。,13,其次，可以通过基因工程技术引入单一位点的突变来提高蛋白质的稳定性：1）引入更多的内部或表面的二硫键2）增加内部氢键的数目3）改变内部疏水堆砌4）增加表面离子键5）增加金属结合位点数目,14,必需的功能基团的维持和正确的空间排布是蛋白质具有活性的基础。而任何非正常的共价过程则会引起蛋白质活性的丧失。功能基团本身的共价修饰，导致基团功能不能起作用。蛋白质上任何基团的共价修饰，使得三维结构受到破坏。,2.4共价过程中导致的失活,15,2.4.1活性中心上必需基团的反应,研究证明，某些具有化学反应的化合物可与蛋白质的功能性基团反应，导致蛋白质失活。氧化剂酰化剂烷化剂芳香环上的替代,16,1）表面基团性质的改变，会对蛋白质稳定性有着重要的影响。Eg：蛋白质表面极性基团非极性基团蛋白质内部重新折叠蛋白质表面极性基团强极性基团蛋白质更加稳定,2.4.1基团的化学修饰对三维结构的维系,17,2）基团的化学修饰导致蛋白质的变性蛋白质内部的非极性基团不会与化学试剂相接触，但在不完全变性状态下，可逆的伸展过程导致这种基团转移到表面，此时，如果他们被化学修饰，那么将不能够再回到原始的天然结构，或很难回到，从而使蛋白质发生变性。,18,3）蛋白酶等一些酶类的水解会导致肽键或糖苷键等重要的键被破坏，从而引起蛋白质失活。,19,2.5对策,避免细菌的污染（细菌酶类会破坏蛋白质重要的化学键）。低温、干燥和固态有利于蛋白质的保存。抗菌剂可能会通过化学修饰破坏蛋白质活性，需谨慎使用。高浓度的化学物质（尿素、盐酸胍、表面活性剂、金属螯合剂