微生物的实验室培养PPT课件

.,1,专题2微生物的培养和应用,.,2,特点：小;简单;低等;代谢速度快。,一、微生物：,1、包括:,是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,原核生物,非细胞结构,真核生物,.,3,常见的三种细菌典型形态A.球菌B.杆菌C.弧菌,.,4,芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.,芽孢：椭圆形的休眠体,.,5,酵母菌和霉菌,.,6,二、培养基,人们按着微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。,1、概念,.,7,微生物主要化学元素组成：,2、微生物的营养,C、H、O、N、P、S,1）、一般都含有水、碳源、氮源、和无机盐。2）、还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求,.,8,营养元素,碳源谱,有机碳,无机碳,异养微生物,自养微生物,氮源谱,有机氮,无机氮,NH3铵盐硝酸盐N2,蛋白质核酸氨基酸尿素,注：对于异养微生物，含C、N的化合物既为碳源，也是氮源。,.,9,微生物生长不可缺少的微量有机物如：维生素、氨基酸、碱基等,生长因子：,牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类。的水溶性物质。,牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素。,.,10,氮源、能源、生长因子,碳源、能源、生长因子,.,11,按成分不同划分,天然培养基,合成培养基,化学成分不恒定的天然有机物,牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。用于工业生产,化学成分完全了解的物质配制而成的培养基,高氏1号培养基、查氏培养基。用于分类和鉴定,分类,.,12,一般用锥形瓶盛装,按物理状态不同划分,固体培养基,液体培养基,在液体培养基中加入一定量凝固剂，使其成为固体状态，琼脂含量一般为1.5%-2.0%,琼脂含量一般为0.2%-0.7%,不加任何凝固剂,半固体培养基,固体培养基常用来进行微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏,观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定,大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究,一般用试管或培养皿盛装,.,13,按用途不同划分,基础培养基,鉴别培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）,用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基,用于鉴别不同类型微生物的培养基,选择培养基,微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化,在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长,.,14,加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:,几种选择培养基举例：,分离酵母菌、霉菌等真菌,分离固氮菌,分离自养型微生物,唯一碳源为纤维素的培养基,分解纤维素的细菌,.,15,【例】以下是单克隆抗体制备流程示意图：,根据培养基的_分类，图中HAT培养基属于_培养基,选择,用途,.,16,培养基配置原则,目的明确,营养协调,理化条件适宜,经济节约,根据不同的微生物的营养要求配制针对强的培养基。,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累,如：pH,.,17,二、无菌技术,（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。,（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。,（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。,（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,.,18,【2010广州调研】下列实验方法及其结果合理的是A稀释的鸡蛋清溶液与蛋白酶混合后用双缩脲试剂检测会发生紫色反应B酒精溶液与重铬酸钾溶液混合后在沸水浴条件下才会出现灰绿色C在植物组织培养中，可用酒精对外植体进行灭菌,（双选）,.,19,1、常用消毒和灭菌方法,.,20,灼烧灭菌,干热灭菌箱,高压蒸汽灭菌锅,.,21,煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂（70%酒精等）紫外线,针对不耐高温的液体,接种室、超净工作台,能耐高温的，需要保持干燥的物品,灼烧法干热灭菌高压蒸汽灭菌,接种工具（接种环等）,吸管,实验操作者的双手,培养皿等玻璃器皿,培养基,1、消毒方法,2、灭菌方法,干热灭菌,.,22,计算称量溶化灭菌倒平板,三、实验操作,1、制备培养基,.,23,【例2】进行细菌接种培养实验时，以下哪个操作步骤是非必要的？A双手带上胶手套B接种前后都灼烧接种环C接种前后都灼烧菌种试管口和待接种斜面试管口D要丢弃带菌培养基前，进行高压蒸汽灭菌或加热灭菌,.,24,1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,刚刚不烫手时,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,灼烧灭菌，防止瓶口的微生物的污染,有关问题,防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,3.为什么将平板倒置？,.,25,2、纯化大肠杆菌,平板划线法,稀释涂布平板法,平板分离,由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，就是菌落。,根霉曲霉青霉,.,26,将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_,在_旁冷却接种环，并打开棉塞,将试管口通过火焰,.将已_的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液,左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划_条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。,.将试管通过火焰，并塞上棉塞,火焰,冷却,三至五,灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的_开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。,末端,烧红,将平板_放入培养箱中培养。,倒置,.,27,.,28,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,避免接种环温度太高，杀死菌种,使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,.,29,2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,.,30,将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,取少量稀释液滴加到培养基表面,灼烧,待酒精燃尽后冷却810s,涂布,将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀,.,31,(3)菌种培养：,培养基倒置放入37的恒温箱中。,(4)实验结果观察,.,32,稀释涂布平板法获取的菌落,.,33,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,四、结果分析与评价,.,34,3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。,.,35,1.试管低温临时保藏将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔36个月要重新接种培养后再保存）。,2.甘油管长期保藏在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于20OC的冷冻箱中保存。,五、课题延伸-菌种的保藏,搁置斜面,.,36,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,.,37,1、筛选菌株,无机盐,碳源,氮源,凝固剂,尿素是唯一氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长。,.,38,1、筛选菌株,2、统计菌落数目,思考：选用什么方法统计？,稀释涂布平板法、显微镜直接计数,统计菌落数目的关键是,恰当的稀释度,注意：统计菌落数往往比活菌的实际数目低。因此，统计结果一般用菌落数。,.,39,计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积（1mm2）和高（0.1mm）的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个（或16个）中格，每个中格进一步划分成16个（或者25个）小格，但计数室都是由400个小格组成。,.,40,计数室,操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下统计45个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按下面公式求出每毫升样品中所含的细菌数。,计算公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数。,.,41,1、筛选菌株,2、统计菌落数目,3、设置对照,目的：排除非测试因素影响，提高实验结果可信度,潮湿、富含有机物、pH7，选用表层土。,.,42,1、筛选菌株,2、统计菌落数目,3、设置对照,土壤中各类微生物数量不同。一般来说。细菌放线菌真菌。,注意：第一次做实验，稀释范围要放宽。,.,43,从富含有机物、潮湿、pH7的土壤中取样。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1mL接种到已制备好的平板上，为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板上,.,44,然后用无菌涂布棒将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数，计算出同一稀释度菌落平均数。,.,45,三重复组求平均值使结果更准确,做好增加空白对照：,排除无关变量的干扰，证明因变量是由