常规石蜡制片HE染色技术.ppt

光镜下观察组织标本需克服的几个问题,如何保持组织标本取材前的形态？如何制备薄组织片，允许光的通过而便于观察？如何使不同组织结构具有不同的光折射率，便于对标本进行结构的仔细辨别？,光镜标本的基本制作技术,第二章,光镜样本的基本制作技术（组织制片技术）是医学研究和生物学研究中，观察细胞、组织的正常或病理形态变化的一种必不可少的手段，借此可以弥补活体观察的不足同时光镜样本的基本制作技术也是其它光镜标本技术的基础,取材固定漂洗脱水透明浸蜡包埋切片脱蜡染色脱水透明封片,光镜样本的制作的基本过程,第一节取材及固定,医学研究的组织样本来源人体（最好）临床的活检组织尸检组织（取材方法及注意事项按病理学要求进行）正常组织用正常动物的组织材料替代,一、动物致死法,动物的福利，3R原则动物致死法选择致死动作应迅速,1断头法2击头法3麻醉法4股动脉放血法5空气栓塞法,动物致死方法,细胞标本制备,1.印片法2.穿刺法3.沉淀法4.培养细胞标本制备,二、取材及注意事项,1材料保持新鲜2组织块免受挤压3组织块力求小而薄4尽量保持组织的原有形态5选取好组织块的切面6动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置7切除不需要的部分8保持材料的清洁,三、组织固定法,固定是使要观察的组织构造尽量接近它取材前的状态,（一）固定目的1标本不发生离开身体后或死后变化2随后处理中，标本不易损坏3.组织块硬化4使组织内各种结构产生不同的折光率，或对染料具有不同的亲和力,（二）固定方法1蒸气固定法（较细小而薄的标本）2小块组织固定法（直接投入固定液中）3注射、灌注固定法（体积过大或固定液极难渗入内部的组织标本）（1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等）（2）全身灌注固定（小鼠、大鼠、兔、狗、猴、人）4.微波固定法,灌注过程充分暴露心脏针尖插入左心室或升主动脉中快速灌注生理盐水剪开右心耳（或右心房）放血换灌固定液，先快后慢输入,用量1.生理盐水大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、猫200-250ml、猴300-500ml、狗800-1000ml2.固定液动物血液量的2倍动物体重（g）7%20（ml）,无论是局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完毕后，必须立即将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行后固定,1组织块不宜过大2软组织或较大块组织可先经23小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定3固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸4固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组织块的大小而定,（三）固定注意事项及影响因素,1甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是37%40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓度是10%，而实际甲醛浓度只有4%固定小块组织(15152mm)10小时左右经它长期固定的组织，需经2448小时的自来水流水冲洗,四、固定液（一）单纯固定液,甲醛单纯固定液的常用配方10%甲醛水溶液37%-40%甲醛液10ml自来水或蒸馏水90ml10%甲醛生理盐水溶液37%-40%甲醛液10ml氯化钠0.85g自来水或蒸馏水90ml,2多聚甲醛：一种渗透速度极快的甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是新配制的甲醛液，宜临用前配制,4%多聚甲醛单纯固定液的常用配方多聚甲醛4g蒸馏水（或0.2mol/LPB）50ml在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却0.2mol/LPB（或蒸馏水）100ml,3戊二醛：一种常用的醛类固定剂，能较好的保存组织结构，但其穿透力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用时需配制成1%6%的不同浓度,4酒精：单纯固定液为80%95%的浓度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学中的糖原固定酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒精除外）可作为配制混合固定液的基本成分,5其它固定液丙酮苦味酸醋酸重铬酸钾三氯醋酸铬酸氯化汞锇酸,用多种具有固定作用的试剂混合配制的固定液，达到各试剂在固定作用中具有的优缺点平衡目的,（二）混合固定液,常用混合固定液,1酒精-甲醛液（A-F液）95%或无水酒精（A）90ml37%40%甲醛液（F）10ml2Carnoy液冰醋酸10ml氯仿30ml无水酒精60ml3Bouin液饱和苦味酸水溶液75ml甲醛液（37%40%）25ml冰醋酸5ml,4Helly液重铬酸钾2.5g升汞5g蒸馏水100ml（以上是Helly储存液）甲醛液(37%40%)(临用时加入)5ml51%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液多聚甲醛1g蒸馏水50ml在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却25%戊二醛5ml0.2mol/LPB（pH7.4）100ml,第二节固定后处理及切片,一、组织修整固定结束后，将受挤压或不需要的部分组织修切或整形，同时选择好包埋面，称组织修整。修整可在冲洗前、也可放在冲洗后,二、组织洗涤,洗去渗入组织内的固定液，再进行下一步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生化学反应造成后道操作困难1水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤2酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，多采用酒精洗涤,三、组织脱水,（一）脱水意义与脱水剂因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水分，称脱水脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任意比例互相混合,脱水剂中最常用的是酒精。一般从70%酒精开始脱水，逐步升高酒精浓度；脱水时间根据组织块的种类、大小、及使用的固定液种类等因素而定,70%酒精25小时(可长期保存组织)80%酒精25小时90%酒精25小时95%酒精（）25小时95%酒精（）25小时无水酒精（）30分钟无水酒精（）30分钟无水酒精（）30分钟,（二）脱水步骤和时间以18mm18mm，厚约23mm的组织块为例，其脱水步骤和参考时间如下,（三）脱水注意事项1组织脱水必须掌握由低浓度逐步过渡到高浓度的原则2脱水时间要适度3组织脱水要彻底干净,四、透明,（一）透明意义及透明剂组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透明状，故称透明二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜，较大组织块适当延长但不超过2小时,（二）透明步骤和时间为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精之后，先经过酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入纯二甲苯中透明步骤和时间大致如下1无水酒精:二甲苯=1:12030分钟2二甲苯（）2030分钟3二甲苯（）2030分钟,（三）透明注意事项二甲苯必须保持无水组织块脱水过程要彻底,五、浸蜡,（一）浸蜡目的浸蜡是将透明过的组织块在熔化的石蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替组织块中的二甲苯，在随后温度下降中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切片机切片,第1杯熔蜡(软蜡)(熔点54以下)1小时第2杯熔蜡(硬蜡)(5860)1小时第3杯熔蜡(硬蜡)(5860)30分钟整个浸蜡时间控制在3小时之内浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高于石蜡熔点23,（二）浸蜡的步骤,（三）浸蜡注意事项1浸蜡最佳温度应是石蜡刚熔化、或蜡杯底部尚残留小部分未熔完蜡时的温度2浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和标签一齐装入分格篮内浸蜡3石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质4浸蜡用的石蜡要定期更换5新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使其中的挥发性物质蒸发6包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免石蜡无益地加温熔化,六、包埋（石蜡包埋法）,（一）包埋目的及包埋剂包埋是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片石蜡是组织学切片技术中最常用的包埋剂,（二）包埋过程1取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具2.迅速倾注少量熔蜡于包埋框中3.从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底4.加熔蜡至包埋框上缘，将标签纸紧贴旁边5.表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水中（夏天用冰水）急速凝固6.凝结蜡块自动漂浮于水面，或30分钟后推开包埋框，取出蜡块。7.修块,（三）包埋注意事项1包埋蜡的熔点选择2石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性3包埋用石蜡和最后浸蜡的石蜡熔点要相同4包埋中组织块间要有一定距离5石蜡凝固要快速,七、切片,（一）石蜡切片机及切片刀1石蜡切片机最常用的石蜡切片机是轮转式切片机，它的切片刀固定不动，而靠右侧旋转的重轮带动螺纹轴和齿轮，将组织块夹具按所调节的切片厚度向前推进，并在上下平面运动，让组织块经过前下方切片刀而切成一定厚度的切片,2切片刀与磨刀石蜡切片常用的切片刀为平楔型切片刀，也有一次性切片刀非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两种,（二）石蜡切片过程1修块2蜡块和切片刀固定3调整蜡块切面和切片刀角度(10以内)4.调整刀台与标本台距离5.修整蜡块切面，暴露完整组织切面6.调整切片厚度调节器(厚度为68m)7.正式切片8切片展平9贴片和烘片,（1）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高（2）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬（3）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或不平（4）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利（5）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小（6）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或刀或蜡块未固定牢（7）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一（8）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好（9）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角度过小、刀口不锋利（10）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小（11）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥,（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因,第三节苏木素-伊红染色方法,染色是将组织浸入染料配制的染色液中，使组织中的不同结构染上不同颜色或不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构造,染料是一类有色的以苯环为基础的有机化合物，它不同于一般颜料，因为它不但有颜色，更重要的是它对组织的不同成份具有不同的亲和力。构成染料至少必须有两种原子团连接于苯环上，即能使染料显色的原子团-发色团和能使染料对不同组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团（酸、碱性基团）-助色团,分类细胞核染料有天然染料苏木素、胭脂红及人工合成的染料结晶紫、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、焦油紫等细胞质染料有人工合成的伊红Y、酸性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等,媒染剂为有些二价或三价金属物质，如铝、铁、铜、钨等可作为中介媒体物质，使原来几乎不与组织结合或结合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）着色；它主要是通过增加染料对组织中某一成份的亲和能力，自身又与染料或组织发生结合而发挥作用,助染剂（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染料的染色能力，而自身不参与染色反应分化剂（脱色剂、分色剂）用于退行性染色法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色酸性分化剂0.51%的盐酸酒精（95%以下）或较稀的冰醋酸水溶液氧化分化剂苦味酸、铬酸、重铬酸钾、过锰酸钾等媒染分化剂既能促使组织和染料结合，又可使已经结合到组织上的染料脱离,一、苏木素-伊红染色的基本原理,苏木素和伊红染色是组织学中常规制片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，故称常规染色（简称HE染色）,苏木素（或苏木精）是一种天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强它对组织的亲和力，达到染色目的伊红（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质染料；有伊红Y、B、BN等，常用的是伊红Y。伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需加助染剂和分化剂，使染色效果更加好,二、苏木素-伊红染液的配制,（一）苏木素染液一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、硫酸铝钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素中配成溶液另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用媒染剂分色,Harris苏木素染液苏木素1g无水酒精10ml硫酸铝钾（或硫酸铝铵）20g蒸馏水200ml氧化汞0.5g,Mayer苏木素液苏木素1g蒸馏水1000ml碘酸钠0.2g硫酸铝钾50g枸橼酸钠1g水合氯醛50g,醇溶性伊红染液伊红Y0.5g95%酒精100ml水溶性伊红染液伊红Y0.5-1g蒸馏水75ml95%酒精25ml冰醋酸12滴,（二）伊红染液,（三）分化液,去除过度染色或不需要着色的组织成份上颜色的过程，叫分色所使用的试剂配制的液体称为分化液而苏木素的分化过程中，使酸性条件转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由红色转变成蓝色，所以这一过程又称蓝化,1氢氧化铵水溶液（pH7.5-8.0）氢氧化铵（氨水）3ml蒸馏水1000ml21%盐酸酒精溶液盐酸1ml70%酒精99ml,三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、脱水和透明等的作用,石蜡去石蜡去二甲苯水化颜色二甲苯酒精水染液透明脱水水分二甲苯酒精,四、染色程序,（一）脱蜡至水石蜡切片冰冻切片1二甲苯（）5分钟2二甲苯（）5分钟3无水酒精（）5分钟4无水酒精（）5分钟595%酒精5分钟680%酒精1分钟770%酒精1分钟8自来水2分钟3分钟9蒸馏水1分钟1分钟,（二）染色石蜡切片冰冻切片1