酶法提取牛腱胶原的研究叶易春酶提取

酶法提取牛腱胶原的研究叶易春酶提取 第34卷 第7期Vol. 34 No. 7中 国 皮 革 xx年4月CH INA LEATH ER Apr. xx 酶法提取牛腱胶原的研究 叶易春1 Study on extracting collagen of bovine tendon with enzyme 但卫华1, 2 曾睿2, 3 林海1 曲健健1 陈驰1 但年华1, 4 (1 四川大学皮革化学与工程 _重点实验室, 成都610065; 2 四川大学生物医学工程 技术研究中心, 成都610065; 3 四川大学轻纺与食品学院, 成都610065; 4 成都迪澳胶原高技术有限公司, 成都610065) Ye Yichun 1, Dan Weihua 1, 2, Zeng Rui 2, 3, Lin Hai 1, Qu Jian j ian 1, Chen Chi 1, Dan Nianhua 1, 4 (1. The Key Laboratory of Leather Chemistry and Engineering of Ministry of Ed ucation, S ichuan University, Chengdu 610065; 2. The Research Center of Biomedicine Engineering of Sichu an University, C hengdu 610065; 3. Institute of Light, Textile and Food Industry, S ichuan University, C hengdu 610065; 4. Chengdu Diao C ollagen High -tech C o. Ltd. , C hengdu 610065) 摘 要 以牛肌腱为原料, 通过酶法来提取 型胶原, 找出其最佳工艺条件, 并对所提取的胶原进行了性能表征。酶 法水解的最佳条件:进口胃蛋白酶用量的质量分数1%,pH 值2. 5及4 条件下水解作用30h 。研究结果提示:酶解法是比较理想的提取方法, 不仅提取产率高, 而且提取的胶原样品的分子质量高(10万Dal 以上) 且分布窄, 可初步判定其基本维持了天然胶原的三股螺旋结构, 适合作为生物医用材料的原料。 关键词 牛腱 型胶原 酶法 纯化 水解 优化 TS 51 A Abstract T ype collagen was prepared from bovine t endon by enzymat ic met hod treating with pepsin. T he opt imum project was arrived at. T ype collagen prepared w as characterized. T he various physico-chemic al propert ies, such as molec ular weight, IR spectra , DSC and amino acid ponent of bovine t endon collagen were measured. As a re -sult , enzymat ic hydrolysis is t he premium ext rac t ing met hods, w hich is both high extraction rat io, high molecular weight above 100000Dalton and origioal t riple helix structure. T he collagen prepared f its well for biomedic al use. Keywords bovine tendon t ype I collagen enzyme purifying hydrolyze optimize 成分1-2。胶原所具有的特殊的四级结构, 决定了其独特的理化性质和优良的生物相容性、可降解性、低免疫原性以及止血功能等性能3-4。正是这 些优良的性能使胶原深受国内外科学家和企业家的关注与青睐, 而且它在生物体内容易被吸收、亲水性强、无毒安全性好, 故被广泛用作于生物医用 胶原是一种细胞外基质(ECM ) , 属于结构蛋白质, 约占哺乳动物蛋白质总质量的1/3, 是构成皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官的主要 基金项目:国家高技术研究发展计划(国家863计划) 资助项目, 项目编号:xxAA326090; _高等学校博士点专项科研基金资助, 项目编号:1* 第一作者简介:叶易春, 男, 1979年生, 硕士研究生通讯联系人 第7期 叶易春等 酶法提取牛腱胶原的研究 管及边缘软骨, 并尽量除去表面筋膜。清洗干净后, 切成相近尺寸的小块, 用1 1氯仿乙醇脱脂, 打浆, 乙醇浸泡, 再真空干燥备用。1. 3 酶法水解提取胶原 酶法水解的影响因素主要有酶的用量、水解pH 、水解时间以及水解温度。为了方便起见, 根据前期研究的成果, 本文将水解温度这一因素固定, 即酶法水解在04 的条件下进行。关于酶的种类确定, 选用进口胃蛋白酶(活力为1 3000) 。这样, 在本项研究中只需考虑进口胃蛋白酶的用量、水解pH 以及水解时间等3个因素了。在大量探索性试验研究的基础上, 确定每个影响因素的水平数为3个, 按照正交设计法得到酶法水解的正交试验因素水平表和酶法水解正交试验安排一览表, 如表1、表2所示。然后, 按照表2进行一系列试验, 并对试验结果进行统计分析, 从中找出酶法提取牛腱胶原的最佳条件。 表1 酶法水解正交试验因素水平表 L 9(33) p H 123 2. 02. 53. 0 t /h 203040 酶的质量分数/% 0. 51. 01. 5 123456789 专题研究 材料。它已应用于美容、促进伤口愈合和硬组织修复、眼角膜疾病、人造代血浆等方面5-9。 胶原应用广泛, 作为生物材料潜力巨大, 故胶原的提取与纯化就显得十分重要, 这是应用胶原的基础。胶原的提取制备技术历史较长、方法多样。早在1929年就有以磷酸溶解动物骨组织提取胶原的专利技术10, 近几年在这方面也有研究报道 11-14 表2 酶法水解正交试验安排一览表 L 9(33) pH 2. 53. 02. 02. 52. 03. 02. 53. 02. 0 t /h * 酶的质量分数/% 0. 51. 01. 51. 00. 51. 51. 50. 51. 0 。 目前, 胶原的提取方法主要有4种, 即酸法、碱法、盐法和酶法。在当前的研究中, 有关胶原提取的尽管很多, 但是其水解提取的工艺还有待于进一步地完善和优化。概括地说, 在胶原的纯化和提取方面, 应重点解决2个问题, 一是要提高胶原的产率和纯度, 其二则是使目标产物能满足不同应用领域的要求。 本文以牛肌腱为原料, 通过酶法来提取 型胶原, 找出其最佳工艺条件, 并对酶法所提取的胶原进行了性能表征。1 试验部分1. 1 主要试剂与仪器 胃蛋白酶, Sino -American Biot ec 公司; 三羟甲基氨基甲烷, 成都科龙化工试剂厂; 氯胺T , 上海佘山化工试剂厂; 对二甲氨基苯甲醛, 天津新纯化学试剂研究所; 冰乙酸, 上海有机化工试剂研究所。 酸度计pHS-3B, 上海雷磁仪器厂; 电磁搅拌器RCT-basic, 广州仪科实验室技术有限公司; 高速离心机LG10-2. 4A, 北京医用离心机厂; 紫外可见分光光度计U V751GD, 上海分析仪器总厂; 微量移液器, 上海荣泰生化工程有限公司; 微型凝胶电泳仪, Bio -Rad 公司; 差示扫描仪 DSC2000PC, 德国耐池公司; 傅里叶红外光谱仪M AGNAIR560, N icolet, U SA 公司; 高速全自动氨基酸分析仪835-50型, 日本日立公司。1. 2 纯化牛腱的制备 将购买的新鲜牛腱剔除肉质、血 1. 4 酶法水解胶原的性能表征 采用酶法提取的牛腱胶原, 具有重要的医学应用价值。我们对本项研究所获得的牛腱胶原样品进行表征:分析氨基酸组成, 应用DSC 分析胶原的纯度、热稳定性, 通过FT -IR 分析表征胶原的三股螺旋结构, 用SDS-PAGE 电泳法检测胶原分子质量及其分布等。2 结果与讨论2. 1 酶法水解 以产率为评价指标, 对正交试验结果进行分析评价, 结果如表3所示。从表3和图1可以看出:pH 值对水解的影响最大(极差值为12. 32) , 其次 表3 酶法水解正交试验直观分析 pH 1 23456789 总值1( j) 总值2( j) 总值3( j) 均值1均值2均值3极差 2. 53. 02. 02. 52. 03. 02. 53. 02. 037. 4868. 8231. 8612. 49322. 94010. 6xx. 320 t /h *31. 2154. 0752. 8810. 40318. 02317. 6277. 620 酶的质量分数/% 0. 51. 01. 51. 00. 51. 51. 50. 51. 042. 8851. 5243. 7614. 29317. 17314. 5872. 880 溶出率/%28. 7411. 9912. 1517. 963. 769. 4922. 1210. 3821. 57 专题研究 中 国 皮 革 第34卷 -1 是时间(极差值为7. 62) , 酶用量影响最小(极差值为2. 88) 。就pH 值而言, 过低pH 值(此时达到胃蛋白酶最佳活力范围) , 使胶原过度水解生成较多的小分子多肽, 而部分小分子多肽会在中和、离心、纯化、转移等操作中损失掉, 使其产率降低; pH 值过高, 溶液中氢离子浓度越低, 形成氢键的可能性越少, 其溶出率也会降低。可见, 在此条件下的最佳pH 值为2. 5。就时间而言, 时间太短使得水解不够充分; 时间太长有可能导致水解过度而在离心、盐析等操作中损失掉, 从而使产率略有降低。可见, 在此条件下的最佳时间为30h 。就酶用量而言, 酶用量太少, 水解不充分; 酶用量过多, 水解过度, 产率也会有所降低。 表4 胶原样品的氨基酸组成分析 标准 型胶原样品质量 氨基酸 质量分数/%分数/% 苏氨酸1. 601. 62丝氨酸3. 102. 95谷氨酸甘氨酸丙氨酸胱氨酸缬氨酸蛋氨酸脯氨酸亮氨酸酪氨酸赖氨酸组氨酸色氨酸精氨酸羟脯氨酸苯丙氨酸羟赖氨酸异亮氨酸天门冬氨酸 7. 5032. 7011. 400. 002. 300. 6013. 002. 500. 402. 800. 500. 005. 208. 601. 300. 701. 204. 60 7. 9734. 408. 050. 002. 250. 6111. 722. 920. 642. 260. 540. 006. 658. 661. 721. 271. 154. 62 旋结构保持完整。而由图5我们可看出:样品在1339. 04、1412. 74cm 等处是存在吸收峰的, 所以可以认为样品的三股螺旋结构基本保持完整。表5是牛腱胶原样品红外谱图的归属情况。 表5 牛腱胶原红外光谱图的归属 带的位置/cm -1 归属 N -H 伸缩振 酰胺A 带3436. 62动, 表明存在氢 键。 C =O 伸 缩振 酰胺 带1639. 22动, 表明存在羰 基。 N -H 弯 曲振 酰胺 带 1556. 12动, 表明存在氢 键。 2. 2. 2 DSC 分析 应用DSC 对物质进行鉴定, 主要是根据物质的相变和化学反应所产生的特征吸热或放热峰。由于物质的性 图1 酶法水解正交试验效应曲线图 图2 标准 型胶原的DSC 图 结果表明:酶法水解的最佳工艺条件为A 2B 2C 2, 即pH 值2. 5, 时间30h, 酶用量的质量分数1%。影响因素的主次关系为: pH t 酶用量2. 2 酶法水解胶原的性能表征2. 2. 1 氨基酸组成分析 用茚三酮法, 由日立835-50型高速全自动氨基酸分析仪分析氨基酸组成。结果如表4所示。胶原具有比较相似的氨基酸组成, 即大约30%34%的甘氨酸, 脯氨酸和羟脯氨酸共占20%23%, 不含色氨酸, 而脯氨酸是胶原特有的氨基酸。从表4的分析结果可知, 样品与标准 型胶原有着非常相似的摩尔组成。氨基酸的这种组成形式非常符合胶原的一级结构特征, 表明了样品的组分基本为 型胶原, 并且纯度也比较高, 可用作生物医用材料。 质不同, 它们的特征峰也不同, 就像 指纹 一样表征着物质的特征。将样品的DSC 与标准物质的DSC 进行比较, 从起始温度、峰温、峰面积等便可很快对样品进行鉴定。由图2、图3和图4可看出, 样品的峰形与标准 型胶原的峰形基本相似。标准 型胶原的峰温是65. 8 , 样品的峰温是59. 8 ; 而样品的峰形与明胶的峰形相差甚远。所以样品是 型胶原而非明胶。由文献15可知, 试样的纯度越高, DSC 曲线的熔融峰就越尖陡, 峰温也越高。而样品的峰温是59. 8 , 与标准 型胶原的峰温65. 8 相差很小; 样品的熔融峰与标准 型胶原的熔融峰也相差不大。可见样品还是比较纯的, 其纯度略小于标准 型胶原。2. 2. 3 傅里叶变化红外光谱分析 图5是样品的FT -IR 图。根据Plepis 等 -1 16 图3 明胶的DSC 图 图4 样品的DSC 图 的分析, 在12351450 图5 样品的红外光谱 c m 范围存在吸收, 表明胶原的三股螺 第7期 叶易春等 酶法提取牛腱胶原的研究 作用30h 。 (2) 通过研究比较, 在胶原的所有提取方法中, 酶法水解是牛腱胶原比较理想的提取方法, 不仅提取产率高、对环境友好, 而且提取的胶原样品分子质量高(10万Dal 以上) 且分布窄、可初步判定其基本维持了天然胶原的三股螺旋结构, 适合作为生物医用材料的原料。 _ 1 Dan Weihua, Li Zhiq iang, Liao Longli, et al. Skin collagen and its application in ti s - 专题研究 2. 2. 4 分子质量及其分布的测定 7 林炜, 穆畅道, 王坤余, 等. 胶原的性质 及其在医药和化妆品工业中的应用J.中国皮革, xx, 30(15) :8-128 但卫华, 李建民, 李志强, 等. 皮胶原与 组织工程. 皮革科学与工程, xx, 12(3) :12-16 9 周文常, 但卫华, 廖隆理, 等. 胶原蛋白 及其与高聚物形成的复合材料在医学中的应用. 皮革化学与工程, xx, 14(2) :30-33 10刘庆惠, 李勃生. 动物胶原的研究进展 J.海洋水产研究, xx, 23(1) :76-7811李贺, 刘白玲, 陈华林, 等. 酶法提取猪 皮胶原及结构表征J.中国皮革, xx, 31(23) :14-16 12周文常, 但卫华, 廖隆理, 等. 猪皮胶原 的提取及其结构表征. 中国皮革, xx, 33(13) :36-38 13叶易春. 牛腱纯化、水解方法的研究: 学士.四川:四川大学, xx14穆畅道. 胶原蛋白的提取及其生物膜材 料研究:博士后论文.四川:四川大学, xx 15四川大学. 分析化学M.北京:科学出 版社, xx 16Plep is A M D G, Goi ssi s G, Das-Gupta D K . Dielectric and p yroelectric characteriz ation of ani on ic and n ative collagen. Pol ymer Eng. Sci . , 1996(36) :2932-2938 图6 酶法优化方案的SDS-PAGE 图 sue engineering. The fifth Asian Interna -tional Conference of Leather Science and T echnology, xx:165-175 2 李国英. 胶原的类型及结构特征J.中 国皮革, xx, 31(17) :20-21 3 Alain Huc. Collagen biomaterials charac -teristies and application. 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