基因工程的基本操作程序教学

.,基因工程的基本操作程序,.,抗虫棉的培育的过程：,.,基因工程的基本操作程序,（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定,基因表达载体的构建,.,一、目的基因的获取,1.目的基因：2.获取方法：,（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成,主要指的是编码蛋白质的结构基因,.,补：原核细胞的基因结构,编码区下游,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,启动子,终止子,补：真核细胞的基因结构,内含子,外显子,RNA聚合酶的始结合位点,RNA聚合酶的末结合位点,.,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,.,（一）从基因文库中获取目的基因（序列未知）,1.基因文库,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,.,基因组文库的构建模式图,.,部分基因文库的构建模式图,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,.,解旋酶催化,1)解旋,模板,2)合成互补子链,以母链为模板进行碱基配对(在DNA聚合酶的催化下,利用游离的脱氧核苷酸进行),母链（旧链）子链（新链）,子代DNA:,同时进行(边解旋边复制),3)形成新的DNA分子,补：DNA复制过程：,作用：把单个脱氧核苷酸连接成链(形成磷酸二酯键),.,2.利用PCR技术扩增目的基因,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,.,PCR技术的操作过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,.,PCR技术的操作过程,.,PCR技术的操作过程,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,.,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋边复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等,.,过程：,变性、退火、延伸三步曲,变性：9095退火：5560延伸：7075,.,3.人工合成法,利用DNA合成仪人工合成的前提：基因较小，核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,.,课堂小结,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,归纳：获取目的基因的方法,.,思考：为什么要构建基因表达载体？（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。,二、构建表达载体,.,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。,.,2.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,.,启动子：终止子：标记基因：,位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。,位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能终止mRNA的转录。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,.,相同点：不同点：,思考：载体与表达载体的异同,都有标记基因和复制原点。,表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。,.,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶切割,两个切口获得目的基因,DNA连接酶连接,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,用同一种限制酶分别切割目的基因个质粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA连接酶使之连接,.,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,.,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法,.,（1）农杆菌转化法,特点：,Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,.,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,.,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,适用于单子叶植物,.,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,.,2.将目的基因导入动物细胞,（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）,思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？,.,（2）操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到输卵管或子宫,受精卵发育,新性状动物,.,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,.,受精卵体细胞,受精卵,细胞/个体,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,用Ca2+处理成感受态细胞,小结：将目的基因导入受体细胞,.,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,1,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,.,四、目的基因的检测与鉴定,检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定,.,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA分子杂交技术（DNA与DNA）,变性,变性,1、检测分子水平的检测,.,变性,方法,DNA与mRNA杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,1、检测分子水平的检测,.,1、检测分子水平的检测,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,.,（二）鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,.,目的基因的表达和检测,.,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞感受细胞法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译；个体,.,课堂练习,1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,.,课堂练习,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,D,.,课堂练习,3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,.,课堂练习,4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达,C,【拓展深化】只有第三步将目