工业微生物杂交育种修改.ppt

第九章工业微生物杂交育种,第一节微生物杂交育种第二节细菌杂交育种第三节放线菌杂交育种第四节酵母菌杂交育种第五节霉菌的杂交育种第六节微生物原生质体技术,第一节微生物杂交育种,杂交的意义：第一，通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种。第二，通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应。第三，通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学原理的发展。,微生物杂交育种基本程序,微生物杂交育种一般程序：,亲株A,亲株B,亲本选择,亲本标记和亲和力测定,亲株A,亲株A,标记,亲和力,亲和力,标记,A+B+C-D-,A-B-C+D+,A+B+C+D+,双亲本杂交,重组及重组体分离,微生物杂交程序,杂交过程中亲本和培养基的选择,（一）亲本菌株的选择,（二）培养基,杂交过程中常用的培养基有完全培养基（CM）、基本培养基（MM）、有限培养基（LM）和补充培养基（SM）。完全培养基，是一种营养成分复杂而丰富的培养基。其主要原材料都来自于天然有机物。在杂交育种过程中利用它和基本培养基配合来检出重组体。,基本培养基，是营养成分简单而贫乏的一种培养基。其配制的原材料基本上都是无机化合物。在杂交育种过程中相当重要，不论是营养缺陷型的筛选，还是重组体的检出、鉴别都是不可缺少的一类培养基。有限培养基，是专供异核体菌株生长使用的培养基。通常在基本培养基或蒸馏水中加入适量（10%20%）的完全培养基，加入的量只限两直接亲本菌株稍许生长，以提供相互接触、吻合的菌丝体需要。加量过多，菌丝体也随之增多，会影响异核体菌株的检出。,杂交育种的遗传标记,（一）营养缺陷型标记,（二）抗性标记,（三）温度敏感标记,（四）其它性状标记,杂交育种方法,1.常规杂交育种,微生物常规杂交形式,2.原生质体融合育种,第二节细菌杂交育种,一、细菌繁殖和遗传结构,二、细菌杂交的概况和原理,（一）细菌接合与F性因子,供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程。Conjugationisthemechanismbywhichgeneticmaterialistransferredbetweentwocellsbyplasmids.,11,12,F因子的特性F因子可以转移；F因子可自发失去；F因子可经吖啶橙等处理而失去；F因子一旦消失不能再现，除非与另外的F+细胞接触而获得；F因子可自体复制F因子的存在状态自主态：含有自主态F因子的细胞叫F+细胞整合态：含有整合态F因子的细胞叫Hfr细胞,F因子的四种细胞形式,b）F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；,a）F+菌株，F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。,c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。,d）F菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。细胞表面同样有性菌毛。,1）F+F-杂交,杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞,理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株,F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。,Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。,2）HfrF-杂交,Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leadingregion)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。,染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。,F因子不易转入受体细胞中，故HfrF-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。,3）FF-杂交,Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F因子。,FF-与F+F-的不同：给体的部分染色体基因随F一起转入受体细胞,a）与染色体发生重组；,b）继续存在于F因子上，形成一种部分二倍体；,细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediatedtransduction）。,18,F+与Hfr菌株的异同点,三、细菌杂交方法与技术,1.杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得,（1）杂交亲本菌株根据试验选择不同遗传特性的两亲本菌株，并且要带一定选择性标记和非选择性标记。这些携带有一定选择性标记和非选择性标记而用于杂交配对的菌株为直接亲本。,（2）标记菌株最常用的标记为营养缺陷（选育方法前述）,（3）性别菌株的获得,F+菌株，F+F-F+,F-菌株，F+菌株F-菌株,吖啶橙处理,Hfr菌株，可通过F+菌株和F-菌株杂交获得。,方法：将A平皿上的F+菌株菌落影印到铺有F-菌株的基本培养基B平板上，经培养后，在B平皿上因个别细胞杂交而出现重组体菌落，这样就可以在A平皿上的相应位置上获得Hfr菌株。,2.杂交的方法,细菌杂交一般采用直接混合法：将两个直接亲本菌株，如Hfr菌株和F-菌株分别培养至对数期新鲜肉汤培养液中，进行震荡培养，细胞浓度约达到2108ml-1。将Hfr菌株和F-菌株细胞以1：10或1：20的比例混合，在37度水浴中缓慢震荡，以利于菌株细胞间接触和接合，在注意保温和良好通气条件下培养一定时间，让亲本菌株间的染色体进行连接、交换和重组。杂交后的混合液用缓冲液稀释，分离到基本培养基上或其他选择培养基上，培养后可得到各种原养型的重组体的菌落。,第三节放线菌杂交育种,一、放线菌细胞结构与繁殖,放线菌菌丝细胞的结构基本上与细菌相似:(1)细胞壁主要也由肽聚糖组成,但各种放线菌细胞所含肽聚糖的成分有所不同.(2)含胞壁酸、二氨基庚二酸，不含几丁质、纤维素.(3)菌丝细胞革兰氏染色一般呈阳性。在形态上和生理上与细菌又有显著的差别。,放线菌菌丝细胞的结构,最常见，如链霉菌属等大多数种类,如孢囊链霉菌属或游动放线菌属,任何菌丝片段：各种放线菌,放线菌的生长与繁殖,二、放线菌杂交概况和原理,（一）放线菌杂交原理,放线菌杂交在原理上基本上类似与大肠杆菌，通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组。,一部分放线菌在杂交过程中会形成异核体，但这种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程中染色体不发生交换。,一部分放线菌在杂交过程不形成异核体，真正类似于大肠杆菌杂交，两个不同基因型的菌株通过接合，细胞间沟通，供体菌株的部分染色体转移到受体菌细胞中，染色体发生交换，最后达到重组，获得各种重组体。,放线菌杂交原理示意图,放线菌的杂交只发生在具有一定感受态菌株之间,据研究发现，在放线菌中也存在类似于大肠杆菌性因子的质粒,（二）放线菌杂交过程,接合杂合系和重组体杂合系重组体,三、放线菌的杂交技术,放线菌杂交方法：混合培养法、玻璃纸法和平板杂交法等几种。,第四节酵母菌的杂交育种,酵母菌子囊孢子的接合现象是在1819年发现的，1938年酵母菌杂交获得成功。,酵母菌由于杂交取得了不少成果：,日本小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获得的杂种，其乙醇的产量和菌体生长量都比亲本有显著提高；,面包酵母和酒精酵母杂交的杂种菌株的乙醇生产能力虽然保持原有水平，但发酵麦芽糖的能力比亲株明显地增强，杂种既可用于酒精生产，也可用于面包发酵；等等,一、酵母菌的细胞结构与菌落形态,酵母菌细胞的形态通常有球状、卵圆状、椭圆状、柱状或香肠状等多种，细胞直径比细菌粗10倍左右，如Saccharomycescerevisiae细胞的宽度为310m，长度为520m。因此在光学显微镜下可以模糊地看到它们细胞内的各种结构分化。有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。,酵母菌的细胞结构与其他真核生物基本相同，右图是电子显微镜下的酿酒酵母细胞结构示意图。,酵母菌细胞的构造,啤酒酵母,1.菌落特征：菌落与细菌的相仿，但由于细胞比细菌的大，细胞内有许多分化的细胞器，细胞间隙含水量相对较少，以及不能运动等特点，因此菌落较大、较厚、外观较稠和较不透明。,酵母菌的菌落,2.液体培养：在液体培养基上，不同的酵母菌生长的情况不同。好气性生长的酵母可在培养基表面上形成菌膜或菌醭，其厚度因种而异。有的酵母菌在生长过程中始终沉淀在培养基底部。有的酵母菌在培养基中均匀生长，使培养基呈浑浊状态。,二、酵母菌的生活史和繁殖方式,根据能否进行有性繁殖，可将酵母菌分为：假酵母：只有无性繁殖过程。真酵母：既有无性繁殖，又有有性繁殖过程。,S.cerevisiae(酿酒酵母)的生活史,三、酵母菌的杂交,以有性生殖的酿酒酵母和面包酵母为例，而准性生殖酵母菌的杂交与霉菌基本相同。,酵母菌的人为杂交一般指异接合型菌株的杂交。,杂交过程：子囊孢子诱导、接触、接合、合子形成，直至二倍体细胞出芽为止的一系列过程。,杂交步骤：遗传标记菌株的选择和具有不同标记的异接合型细胞杂交。,（一）标记菌株的选择,常用的标记：营养缺陷型或抗性突变基因、也可根据菌落和细胞形态特征作为标记，如菌落形状、大小、细胞的形状、大小及色素等都是常用的杂交标记。,酵母菌杂交配对亲株的确定：选择各具优良遗传特性的原始亲本从两个原始亲本中分别选出不同接合型的单倍体菌株或单倍的子囊孢子诱变剂处理单倍体菌株，从中获得带有不同营养缺陷基因的亲本菌株。如果杂交采用菌落或细胞形态作为遗传标记，那末配对的亲株可以直接选用原养型单倍体细胞进行杂交。,（二）酵母杂交方法,子囊孢子的制备，子囊孢子的分离和杂种的获得等。,子囊孢子的制备,采用营养成分贫乏的生孢培养基，使二倍体酵母菌细胞在饥饿情况下发生减数分裂而形成子囊孢子。,获得游离的孢子的方法：,（1）采用蜗牛酶处理，水解子囊壁，然后剧烈震荡，释放出子囊孢子，接着加入液体石蜡，摇匀后孢子就聚集于液体石蜡层；,（2）用蒸馏水洗下斜面的子囊，加入1ml液体石蜡和5g硅藻土，在玻璃匀浆器中研磨10min左右，于4500r/min离心10min，破壁后被分离的子囊孢子集中到石蜡层。取含有子囊孢子的石蜡0.05ml，加入15%明胶0.05ml，在琼脂平板上涂布培养，可得到单倍体菌落，移入斜面，经单倍体检验后备用。,2.杂交常用的杂交方法：群体杂交（1）把带有遗传标记的两亲本单倍体菌株移接到完全培养液中，混合培养过夜，使两亲株细胞在生长中充分接合，然后把混合液分离到基本培养基平板上，培养后形成二倍体的杂交菌落；,（2）把两个不同接合型的单倍体亲株细胞以等量混合接种于完全培养液（如麦芽汁培养基）中，适温培养过夜，大约从6h开始形成接合子，如在显微镜下可见到已产生的接合子，其形状似哑铃状，大多数情况下，接合后第一个芽往往从双亲细胞接触融合处首先长出来，这可与接合的单亲细胞出芽状况相区别；（3）当杂交的双亲均为原养型单倍体时，可取已混合培养57h且有接合细胞产生的培养液，划线接种或平板分离到基本培养基上，适温培养后形成菌落，要注意观察其中大菌落的形成，这些大菌落可能就是异接合型的二倍体杂种，见下表。,表-酿酒酵母单倍体和二倍体细胞的区别,同宗菌株的杂交常利用蜗牛酶或蘑菇浸出液中的酶类来水解子囊壁，破壁后的子囊释放出子囊孢子，然后杂交。,酵母杂交和其他微生物的杂交重组一样存在一个共同问题，种间杂交比属间易于获得产量提高的重组体。种间杂交遗传特性比较稳定，属间杂交产物易于发生分离。,第五节霉菌的杂交育种,霉菌在自然界分布很广，与人类生活密切相关，如产黄青霉（Penicillirmchrysogenum）、荨麻青霉、扩展青霉等是抗生素和酶制剂工业上的重要生产菌种。真核微生物杂交的发现是在细菌之后。1953年报道了构巢曲霉（Aspergillusnidulans）的准性生殖。此后利用真菌的准性生殖进行杂交的研究得到很快发展，尤其是不完全菌纲中的微生物繁殖方式主要是准性生殖，而其中许多霉菌又都是发酵工业产品的主要菌种。通过杂交来提高菌种发酵水平，改善品质具有重要意义。,以青霉菌为例，分析霉菌的杂交育种过程,一、霉菌的细胞结构和繁殖1.霉菌细胞结构,由细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体、核糖体、内质网及各种内含物（肝糖、脂肪滴、异染粒等）等组成。幼龄菌往往液泡小而少，老龄菌具有较大的液泡。,：除少数低等水生霉菌细胞壁含纤维素外,大部分霉菌细胞壁主要由几丁质组成.几丁质是由数百个N-乙酰葡萄糖胺分子以-1，4糖苷键连接而成的。几丁质和纤维素分别构成高等和低等霉菌细胞壁的网状结构微纤丝。微纤丝使细胞壁具有坚韧的机械性能。霉菌的细胞膜、细胞核、线粒体、核糖体等结构与其他真核生物（如酵母）基本相同。,细胞壁,由许多菌丝相互交织而成的一个菌丝集团称菌丝体,营养菌丝体密布在固体营养基质内部，主要执行吸收营养物功能的菌丝体,气生菌丝体伸展到空间的菌丝体,这两类菌丝体在长期的进化中，因其自身的生理功能和对不同环境的高度适应，已明显地发展出各种特化的构造。,菌丝体及其各种分化形式,指在其里面或上面可产生无性或有性孢子,有一定形状和构造的任何菌丝体组织,菌落特征：霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，由于不同的真菌孢子含有不同的色素，所以菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。,黑曲霉,青霉,霉菌繁殖方式及生活史,繁殖方式,2.霉菌的繁殖,根霉生活史,接合孢子,孢囊孢子,49,有些霉菌不产生有性孢子，缺乏有性生殖，但是在无性生殖过程中，它的菌丝体会发生类似于有性生殖的遗传现象，即在菌丝体生长过程中，两个不同遗传类型的菌丝细胞接触融合，形成异核体、杂合二倍体、最后经染色体相互交换，产生一个具有新遗传特性的菌株，称为准性繁殖。准性繁殖，包括单倍体和双倍体的转变，这一点和有性生殖相同，但它们之间有本质区别。准性生殖不是通过减数分裂而是借助有丝分裂达到重组的，而有性生殖恰好相反，是通过减数分裂进行重组的。,二、霉菌杂交的原理和杂交技术,准性生殖中体细胞交换和染色体减半都会导致分离。这种分离是指亲代的隐性基因在子代中出现，这种分离发生在形态相同的细胞中，也称体细胞分离。,霉菌杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组和分离现象，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中，然后通过筛选出具有新遗传结构和优良遗传特性的新菌种。霉菌杂交育种过程主要有以下几个重要环节。,52,能进行准性生殖的微生物：Aspergillusnidulans(构巢曲霉);Asp.Niger（黑曲霉）;Asp.sojaePenicilliumchrysogenum（产黄青霉）;Fusariumoxysporum准性生殖的过程异核体形成；（杂合）二倍体形成；体细胞交换和单元化,53,（一）异核体的形成与获得方法,1、异核体异核体细胞：并存有两个不同遗传性状的核的细胞异核体菌丝体：由异核体细胞构成的菌丝体异核体的无性繁殖：产生亲代类型的单倍体分生孢子异核体的生物学意义：具有生长优势；可以储备隐性突变,54,2、异核体的形成,(1)选择亲本A.亲缘关系近B.生活力、产生分生孢子的能力及数量相似C.带不同的遗传标记(2)创造形成异核体的条件A.限制性培养基B.孢子混合数量：106108,55,(3)异核体的证实,-,56,（二）（杂合）二倍体的形成和检出,1、形成：将106107个异核体的分生孢子涂至MM上，长出的少数菌落即为二倍体2、检出：避免异核体分生孢子重新形成异核体的措施MM要十分纯正采用具有分生孢子颜色突变型和营养缺陷型作遗传标记,57,例：Asp.nidulans分生孢子颜色突变w+y-:黄色w-y+:白色w+y+:绿色,异核体：,产生A-B+w+y-(黄色)和A+B-w-y+(白色)分生孢子,二倍体：,产生A+B+w+y+(绿色)分生孢子,58,3、二倍体孢子与单倍体孢子的区别,59,（三）体细胞交换、分离和单倍化,二倍体在有丝分裂过程中发生基因重组，使隐性基因得以表达，由此产生各种类型的分离子。1、体细胞交换与体细胞重组体（1）体细胞交换：在有丝分裂过程中同源染色体发生的交换。由此导致部分基因的纯合化。,60,61,（2）体细胞重组体：通过体细胞交换而形成的分离子。2、有丝分裂定位离着丝粒愈近的基因纯合化的机会愈小，愈远则愈大；着丝粒一端基因的纯合化不影响着丝粒另一端基因的纯合化。,62,63,3、单元化过程与非整倍体及单倍体分离子（1）单元化过程：是在一系列有丝分裂过程中发生的染色体不离开行为的结果。二倍体三体(2n+1)+单体(2n-1),64,65,4、体细胞交换与单元化的区别,（1）分离子及其来源二倍体分离子：来源于体细胞交换及单元化非整倍体分离子：来源于单元化单倍体分离子：来源于单元化（2）二倍体分离子与单倍体分离子判别Asp.nidulans二倍体分离子体积大,66,（3）二倍体分离子与非整倍体分离子判别非整倍体分离子在无性繁殖子代中继续出现另一基因的分离（4）发生概率,67,有性生殖与准性生殖的区别,68,微生物中导致基因重组的各种形式,69,第六节原生质体融合技术,（一）原生质体融合技术简介（二）原生质体融合技术的一般过程（三）其它原生质体技术,70,（一）原生质体融合技术简介,原生质体：微生物或植物去除细胞壁后的结构。原生质体的特性：没有细胞壁；失去细胞刚性，呈球形；对渗透压敏感脆弱。原生质体融合：通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。,71,原生质体融合技术的特点与实践意义,杂交频率高：霉菌、放线菌，10-310-4，酵母、细菌10-510-6受接合型或致育性的限制较少：近亲，远亲均可进行；遗传物质的传递更完整；可以多株同时参与融合；可以采用产量较高的菌株作融合亲株；提高产量性状的潜力较大，可实现多基因重组；有助于建立工业微生物的转化体系原生原体转化。,72,（二）原生质体融合技术的一般步骤,融合亲本的选择与标记；原生质体的制备；原生质体的融合；原生质体的再生；融合子的选择与鉴定；目标菌株的筛选。,73,1.亲本的选择与标记,亲本的选择：具有优良性状；具有一定遗传标记。亲本标记：营养缺陷型或抗药性等；自然标记；细胞质遗传标记：小菌落、Killer等；生产性状本身。,74,2.原生质体制备,1）原生质体制备是指以溶壁酶水解去除微生物细胞壁的过程。过程如下：培养至对数后期；预处理：细菌，亚抑制量青霉素；放线菌，1-4%Gly；酵母，1%巯基乙醇和1%EDTA；破壁：A、高渗溶液作渗透压稳定剂B、破壁酶：细菌，放线菌：溶菌酶霉菌：几丁质酶，纤维素酶酵母：蜗牛酶或Zymolyase浓度、温度、pH、时间，各不相同注意问题：渗透压稳定剂（高渗保护）；考虑再生，脱壁不能太完全。,75,3.原生质体融合,原生质体融合是指双亲原生质体混合在促融剂的作用下，细胞膜合二为一的过程。促融剂：能够诱导原生质体融合的物质称为促融剂，按其性质分为三大类：生物促融剂：病毒类物质；化学促融剂：PEG（聚乙二醇)，Ca2+，Mg2+等，是使用最广泛的促融剂；物理促融剂：电诱导融合电融合：原生质体在电场中极