《原料的预处理》PPT课件

第三章目标产物原材料的预处理,第一节生物材料靶部位的预处理,生物体内的生化成分包括动物、植物及微生物在新陈代谢时所产生的蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、多糖、脂类、脂肪酸以及各种初生代谢物和次生代谢物等，这些物质与生物学、化学、医学、食品科学等学科的发展息息相关，并促进化学工业、食品工业等行业的快速发展。生物材料的选择与培养、生物反应液的澄清与过滤、细胞的破碎与TP的提取、初级分离等预处理工作是生化成分有效分离的前提与基础，直接涉及分离纯化的时效性。,一、生物材料的准备（一）生物材料的选取与要求对于糖、脂、蛋白质、核酸、酶等生化成分，动物、植物和微生物都可以作为提取和制备的原料，所选用的材料主要根据实验的TP来确定。总体来说，主要遵循的原则为：选择有效成分含量高的新鲜材料；来源丰富易得；制造工艺简单易行；成本比较低；综合利用价值高，经济效益好等。,1.选择有效成分含量(1)生物品种：根据TP的分布，选择富含有效成分的生物制品是选材的关键。(2)合适的组织器官：如免疫球蛋白从血液或富含血液的胎盘组织中提取；制备胃蛋白酶只能选用胃为材料等。(3)生物的生长期：生物的生长期对有效成分的含量影响很大。,2.杂质情况难于分离的杂质会增加工艺的复杂性，严重影响回收率、质量和经济效益。选材时，应避免与TP性质相似的杂质对纯化过程的干扰。如胰脏中含有性质较为相近的磷酸单酯酶和磷酸二酯酶，两者难于分开，因此一般不选用胰脏为原料制备磷酸单酯酶，而改用前列腺为原料，因为它不含有磷酸二酯酶，操作简单易行。,3.来源选用来源丰富的材料，尽量不与其他产品争原料。最好能一物多用，综合利用。例如，健康男性的尿液可以生产尿激酶、激肽释放酶、蛋白酶抑制剂、睡眠因子等；用猪心生产细胞色素c和辅酶Q12；用胰脏制备胰岛素和胰酶、胰岛素和胰高血糖素、弹性蛋白酶和激肽释放酶等。,（二）生物材料的采集与保存生物材料保存的主要方法有：速冻、冻干、有机溶剂脱水，制成丙酮粉，浸存于甘油和丙酮中等1.动物材料利用动物作为原料来提取所需物质，同一种物质在不同的生物体中或同一生物体的不同组识中含量差异很大。而且纯化的难易程度也可能差异较大，所以根据需要，合理取材十分重要。,2.植物材料以植物为原料作为提取物，要视植物材料采收是否具有代表性。如从大田或试验田以及实金器皿中收取植物材料作为原始样品，再按原始样品种类（例如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等）分别选出平均样品，然后根据目的要求和样品种类特征，采用适当的方法从中选出供提取的材料，同时还要注意植物的季节性。对于药用植物要求更高。,3.微生物材料用微生物作为原料来提取所需物需满足以下要求：不是致病菌，不产生毒素，要经过毒理学试验；不易突变退化，不易感染噬菌体；产量高；能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养；注意生长期，在微生物的对数生长期，酶、蛋白质、核酸的含量都较高。,二、生物材料靶部位的预处理（一）动物材料的预处理：对于动物组织，必须选择有效成分含量丰富的脏器、组织为原料，并先进行绞碎、匀浆、去脂肪、去皮筋等处理。,（二）植物样品的预处理1.种子样品的处理：首先去除杂质，后进行研磨、粉碎，过80-100目筛，混合均匀保存，贴上注有采样地点、特性、日期和采样人等内容的标签，若长期保存还要用蜡封，在容器中放入一点樟脑或对位二氯甲苯。,2根、茎、叶、果实样品的处理：对于刚采回的新鲜样品，一般要经过净化、杀青、烘干或风干一系列前处理。净化：从产地采回的新鲜样品常常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦干净，勿用水冲洗（大量样品的提取除外）；杀青：为使样品的化学成分不发生转变或损耗，需及时中止样品中酶的活性，将样品在105的烘箱中杀青15-20min；烘干：样品经过杀青之后，可自然风干，也可立即降低烘箱温度，维持在70-80直到样品烘干为止，一般8-12h。,（三）微生物样品的预处理随着科学技术的发展，大多数自然界存在的有机物都可以通过微生物发酵获得，尤其是蛋白质、酶、核酸等物质。因为微生物具有种类多、繁殖快、容易培养、代谢能力强等特点，若从微生物发酵液中提取TP，第一步就是对发酵液进行预处理，以改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中分离固形物的速度，提高固形物分离器的效率；尽可能使产物转入处理后的某一项中（多数是液相）；取出发酵液中部分杂质，以利于后续各步骤的操作。,第二节生物反应液的预处理,生物反应液中的杂质很多，其中有些杂质不仅影响提取物的质量和提取率，同时对后续的分离、提取和精制有较大影响。,一、无机离子的去除发酵液中的无机离子主要有Ca2+、Mg2+和Fe2+等。Ca2+草酸钠Mg2+三聚磷酸钠Fe2+黄血盐,二、杂蛋白质的去除（一）沉淀法蛋白质是两性电解质，它的稳定性与所带的电荷有关。大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内(pH4.0-5.5)，但是仅靠调节pH还不能使大部分蛋白质沉淀，必须与其他方法共用。（二）变性法变性蛋白质的溶解度较小，容易形成沉淀而除去。蛋白质具有热敏感性，一般在70-80发生不可逆变性，有的甚至在50就会变性。,（三）凝聚和絮凝要从出发酶液中获得澄清酶液就需要过滤或离心，为了加快过滤速度，提高分离效果，出发酶液需要通过凝聚和絮凝技术处理，改变细胞、细胞碎片和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其凝结成较大颗粒。凝聚(agglomeration)指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝聚的现象。絮凝(flocculation)则是指在某些高分子絮凝剂（通常为含有极性官能团的聚合物）的架桥作用下，将胶体粒子交联成网，形成10mm大小的絮凝团的过程。聚丙烯酰胺类衍生物、聚丙烯酸类阴离子絮凝剂,（四）吸附法利用某些吸附剂对蛋白质的吸附作用，也可以除去杂蛋白质。例如，在枯草芽抱杆菌发酵中，常常加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体和其他不溶性离子吸附并包裹在其中而沉淀出来。,三、色素及其他物质的去除发酵液中的色素可能是微生物生长代谢过程分泌的，也可能是培养基带来的，色素物质化学性质的多样性增加了脱色的难度。工业上应用的价廉而有效的脱色剂是活性炭。活性炭脱色的机制是吸附，它既能吸附色素，也能吸附部分酶。,第三节发酵液的澄清与过滤,微生物发酵液中除了酶和其他代谢产物外，还存在大量的菌体和培养基残渣，如不经过固液分离，而将其中的菌体和残渣全部包括在酶制剂之中，这样根本就谈不上任何程度的纯化。若用于食品工业，不仅会影响食品风味，而且影响食品安全，损害人体健康。固液分离的主要方法是离心分离和过滤，对微生物酶发酵液进行的固液分离，国内外常用的设备是转鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。,一、影响发酵液过滤的因素发酵液的过滤速度与菌种、各种发酵条件等因素有关。菌种、培养基、发酵时间。二、过滤技术的种类1.根据过滤介质截留的物质颗粒大小，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反渗透四大类。过滤介质有多种，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。2.根据过滤机制的不同，过滤可以分为澄清和滤饼两种。0.1g/100mL3.此外，根据过滤对产生推动力的条件不同，粗滤又可分为常压过滤、离心过滤、加压过滤和减压过滤四种。,三、过滤性能优化的途径在生产中常常会遇到难以过滤的发酵液，因此需要通过改善过滤性能来提高过滤速度。除了采用絮凝和凝聚等方法外，还可以采用稀释、加热等方法降低发酵液的黏度，或通过加入助滤剂、酶降解等方法，也可以改善发酵液的过滤性能。,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，从而提高滤速。硅藻土、纤维素、石棉粉、珍珠岩等。使用助滤剂的方法有两种：在过滤介质表面铺一层助滤剂；把助滤剂加到发酵液中。非TP之间的反应,第四节细胞破碎与靶物质初步分离,一、细胞破碎生物体内的生化成分种类繁多，存在于不同部位。如青霉素酰化酶、碱性磷酸酶、乙醇脱氢酶等，必须在分离纯化前先将细胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，才能进行提纯。不同的实验规模、实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。破碎组织细胞的方法有很多，依照原理分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法四类。,（一）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法称为机械破碎法。机械法的处理量大，组织细胞破碎速度较快；易因发热，导致样品中活性物质的局部变化。1.组织捣碎机破碎法2.研磨破碎法3.匀浆破碎法高速匀浆器,（二）物理破碎法利用温度、压力、超声波和渗透压等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。常用的物理破碎法有反复冻融法、压力差破碎法、超声波和微波破碎法等。,1.反复冻融法反复冻融法是一种利用温度的变化，通过细胞的热胀冷缩作用来破碎细胞的物理方法。生物组织经冷冻后，一方面细胞膜的疏水键破裂，细胞的亲水性增加；另一方面细胞结成冰晶，细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。,2.干燥法可采用多种方法使细胞干燥，如空气干燥法、真空干燥法、喷雾干燥法和冷冻干燥法等。干燥法使细胞壁膜间的结合水丧失，细胞渗透压改变。当用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，细胞内物质就很容易被抽提出来。空气干燥法适用于酵母，真空干燥法适用于细菌，冷冻法适用于不稳定的酶。,3压力差破碎法通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。常用的方法有高压冲击、突然降压及渗透压变化等方法。（1)高压冲击法是在结实的容器中装入细胞和冰晶、石英砂等混合物，然后用活塞或冲击锤施以高压冲击，压力可达50500MPa,从而使细胞破碎。(2)突然降压法又称为爆炸式降压法。该方法是将细胞悬浮液装入高压容器，通入氮气或二氧化碳，加压550MPa，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后骤然排出气体，使压力骤降至常压，导致细胞迅速膨胀而破碎。,(3)渗透压破碎法是一种较温和的细胞破碎法。将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者转入渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀而破裂。,4改进高压法改进高压法（Xpress法）是将浓缩的菌体悬浮液冷却至3025形成冰晶，利用500Mpa以上的高压冲击，将冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞由于冰晶的磨损变脆而破碎。该方法的细胞破碎率高，碎片的粉碎程度低，活性的保留率高，但是不适用于提取对冷冻融解敏感的酶。,5超声波破碎法通过超声波使细胞膜产生空穴的作用而使细胞破碎。超声波的频率对细胞破碎的效果没有显著影响，通常采用的频率是1525kHz，所破碎细胞的程度除与输出功率和破碎时间密切相关外，还受细胞浓度、溶液黏度、pH、温度以及离子强度等因素的影响，使用时需根据细胞的种类和酶的特性而加以选择。,6.微波破碎法微波破碎细胞专利技术是基于微波加热的选择性、瞬时性和高效性，控制适宜的微波条件而实现细胞破碎。其原理是将含水分的微生物菌体及植物组织置于一定强度的微波场中处理，使细胞受热，水分汽化，内压增大而导致细胞破碎。,（三）化学破碎法某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或细胞膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来，这种处理方法称为化学渗透法或化学破碎法。常用的化学试剂是有机溶剂和表面活性剂。,（四）酶学破碎法（即生物学法）通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到破碎细胞的方法称为酶学破碎法，或称为酶促破碎法。这是一种应用较广泛的方法，其原理是利用酶反应分解破坏细胞壁组分间的特殊化学键，从而达到破碎细胞的目的。酶溶法可分为外加酶法和自溶法两种。,1.外加酶法外加酶法就是根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶，破坏细胞壁，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。其中溶菌酶(lysozyme)的应用最广，能专一地分解细胞壁上肽聚糖蛋白分子的1，4糖苷键，主要对象为革兰氏阳性细菌。该法的优点在于专一性强，条件温和，但是费用较贵，一般只适用于小规模研究。,2.自溶法自溶法(autolysis)是一种特殊的酶溶方式，所需的溶胞酶由生物细胞自身产生。当细胞在一定的pH和适宜的温度条件下保温一段时间后，即可通过细胞自身存在的酶系将细胞破坏，使细胞内物质释出，其效果取决于自溶条件。,二、TP的选择性释放细胞破碎的目的是要得到一种或多种TP。因细胞内存在着许多生物物质，有的放矢地选择性释放TP,而使其他物质尽量少的释放出来就显得十分重要。如利用化学渗透法选择性释放TP（图10-2）。,选择性释放TP的一般原则如下：(1)仅需破坏或破碎TP存在的靶位点。当TP存在于细胞膜附近时，可采用酶学破碎法、反复溶冻法等较温和的方法；当TP存在于细胞质内时，则需采用较为强烈的机械破碎法。(2)选择性溶解TP。当TP与细胞膜或细胞壁结合时，一方面调整溶液的离子强度、pH或添加表面活性剂、螯合剂等与TP有亲和性的试剂，使TP溶解释放；另一方面注意溶液的性质，使其他杂质不易释放。,三、TP的提取提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理原料，并从原材料中把有效成分分离出来的过程。经过预处理和细胞破碎的原材料，可用缓冲液、稀酸、稀碱或有机溶剂等抽提有效成分，甚至还可以用蒸馏水直接抽提。理想的抽提溶液一般应具备如下特点：对有效成分溶解度大而破坏性小；对杂质不溶解或溶解度很小；来源广泛、价格低廉、操作安全等。抽提的原则是“少量多次”，即对于等量的用于抽提的溶液，分多次抽提比一次抽提效果要好。,四、TP的初级分离TP的初级分离是指清除大量非TP。常用的方法主要有沉淀法、超滤法和透析法等。（一）沉淀法沉淀法也称溶解度法，其纯化生物成分的基本原理是：根据各种物质的结构差异，如蛋白质分子表面疏水集团和亲水集团之间比例的差异等，来改变溶液的pH、极性、离子强度和金属离子等，使抽提液中有效成分的溶解度发生改变，从而分离出有效成分。,（二）超滤法超滤法是通过在溶液的表面施加一定的压力，并通过一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的纯化方法。在一定压力下，溶液中的溶剂和小分子可透过选择性薄膜，而大分子则受阻而被截留。（三）透析法透析法是指将待处理的溶液放于具有半透膜性质的玻璃纸袋中，然后将纸袋放在水中或适当低离子强度的缓冲液中，无机盐及一些小分子的代谢产物，由于扩散作用通过半透膜而被去除,TP则仍然保留在袋中。,五、预处理应用范例（一）从乳牛胸腺中提取胸腺素从乳牛胸腺中提取胸腺素的基本过程是：对所选取的新鲜、健康乳牛胸部的胸腺去脂肪、去结缔组织和去血污后，用无菌水洗涤，经20冷冻保存，剪碎，加灭菌生理盐水，匀浆，再于20反复冻融，用HCI调节pH，室温抽提并离心，取上清液，调pH至中性，置80水浴保温20min，然后骤冷离心，收集上清