代谢工程与调控 第五章

第七章支架技术及RNAi,蛋白质支架DNA支架RNA支架RNA干扰,支架技术,？,代谢途径的中间产物可能对宿主产生毒性，被竞争途径消耗，或通过分泌丢失。解决这些问题的一个新兴的策略是将合成途径的酶组合成多酶复合物。多酶复合物在自然界中很常见，例如：由丝氨酸合成色氨酸的反应过程中，催化色氨酸合成的最后两个步骤的酶可以形成复合物，中间产物吲哚通过一个通道由一个活性位点到达另一个。,酶支架技术产生的背景,由丝氨酸合成色氨酸,丝氨酸色氨酸,多酶复合物的晶体结构,多酶复合物形成一个分子内通道，该疏水性通道连接和活性位点。中间产物吲哚，由亚基产生(reaction)，通过该疏水性通道，分子内转运到亚基，与L-丝氨酸反应生成L-色氨酸(reaction)中间产物吲哚是一个疏水性物质，如果在反应过程中不加以引导，它可能会穿过细菌细胞膜而无法发挥作用。该通道可以防止吲哚在催化反应的过程中扩散到溶剂中。,将合成途径的酶组合成多酶复合物是将途经中的酶共定位形成最优比例的复合物，可以增加途径代谢产物和酶的局部浓度，限制途径中间体的积累，减少与其他细胞成分之间不必要反应的发生。将酶组合成复合物的一种方法是将催化连续反应的酶进行融合。酶-酶融合策略在某些情况下能够增强途径通量。但是其存在以下缺点：不适用于包含超过两个酶的途径；融合之后经常会导致一个或者两个酶活性的降低；不能轻易地改变复合物中酶的比例。,酶的合成支架技术为途径中两个或多个酶的共定位提供了新的方法。蛋白质、DNA和RNA都可以作为支架用于酶复合物的形成。,蛋白质支架及其应用,蛋白质支架的应用-甲羟戊酸的生物合成,甲羟戊酸的生物合成途径，由乙酰辅酶A生产甲羟戊酸，包括三个酶：乙酰乙酰辅酶A转移酶(AtoB)羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)合成酶(HMGS)羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶(HMGR),甲羟戊酸的生物合成途径图解,DueberJE,WuGC,Nat.Biotechnol，2009,27:753-759.,三种酶的活性不同，存在HMGS和HMGR之间流量不平衡的问题，导致中间产物羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)的积累。HMG-CoA对宿主大肠杆菌细胞具有很强的毒性。,蛋白质支架,通过蛋白质支架将HMG-CoA这个中间产物的产生酶(HMGS)和消耗酶(HMGR)之间共定位。调节两个酶的比例，使甲羟戊酸的产量提高了10倍。通过另外一个支架分子将途经的第一个酶(AtoB)引入到复合物中，使甲羟戊酸的产量较无蛋白支架的对照提高了77倍。,蛋白与蛋白的相互作用区域与配体来自于动物细胞SH3和PDZ域-mouseGBD域-rat将其插入到大肠细胞中，设计调节机制蛋白支架上结构域的数量直接控制酶的比例,配体,途径中的限速酶是HMGR，需要增加羟甲戊二酰辅酶A到甲羟戊酸这一步的流量。HMGS的C端可以与不同数量的SH3配体结合，HMGR的N端可以与一个SH3配体结合，从而形成不同酶比例的酶复合物,甲羟戊酸的产量提高了10倍,HMGS和HMGR的双酶支架,AtoB以及HMGS和HMGR的三酶支架,甲羟戊酸途径中酶的表达由启动子PTET控制，支架的表达由启动子PBAD控制配体GBD、SH3、PDZ分别与AtoB、HMGS以及HMGR这三个酶结合，通过改变配体的数量(X、Y、Z)形成不同比例的多酶复合物,九个不同的多酶复合物表现出很大的差异，最终GBD1SH32PDZ2多酶复合物相比于无支架的酶，产量提高了77倍,蛋白质支架的应用-葡糖二酸的合成,该途径中，限速步骤的酶是(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)。MIOX可以被其底物肌醇激活。通过蛋白支架，增加了MIOX周围肌醇的浓度，进而使葡糖二酸产量提高5倍,DNA支架及其应用,DNA支架应用-用于GOx和HRP,GOx与HRP共作用反应机理,ABST-为显色物质,WilnerOI,WeizmannY,Nat.Nanotechnol.,2009,4:249-254,组装的DNA纳米结构，由单条的核苷酸链组成，每条链预先设计好互补序列，通过杂交可以形成六边形结构。剩余的10个碱基相当于一个铰链，可以使得DNA支架与生物大分子结合。(注意：将此结构描述成六边形是为了阐明DNA自主装结构的形式，实际情况下，该结构会发生扭曲，但由于杂交，它们保持环状结构）,DNA支架的结构,酶与DNA支架结合,通过赖氨酸残基与DNA寡核苷酸共价交联,分别以两个六面体和四个六面体的DNA结构作为葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的DNA支架当酶的间距由从4个六面体(约33nm)缩短到2个六面体(约13nm)，产物的产量有了显著的增加。原因：距离远使得生成的H2O2扩散到体系中，导致HRP活性位点周围的H2O2浓度较低，从而最终产量低,DNA支架需要与生物大分子结合，设计时应注意使支架的结构灵活，稳定性较低，以避免其对生物大分子的结构产生影响，从而影响生物大分子的催化作用,设计DNA支架时需注意的问题,RNA支架及其应用,在RNA结构模块中包含蛋白质的适配体域，用于结合需要共定位的蛋白,优点：可根据需要将RNA支架聚合成一维支架或者二维支架。缺点：RNA结构较不稳定，设计结构时较为复杂，操作繁琐,RNA支架,可合成一维或者二维的RNA支架，将酶定位在支架上,RNA支架应用-氢酶和铁氧还蛋白的共定位,DelebecqueCJ,LindnerAB,Science,2011,333:470-474.,RNA支架(D0)结构模块中包含PP7和MS2适配体域用于结合PP7(氢酶)和MS2(铁氧化还原蛋白),RNA与蛋白结合原理图,RNA结构中包含二聚区域(DD)和多聚区域(PD)，为了防止回文序列的倒塌,多聚区域分子内折叠，形成具有保护功能的发夹结构，该发夹结构与DD区域重叠，阻止序列倒塌，之后自组装形成功能区域。,构建一维及二维RNA支架的“砖”,将带有两个蛋白适配体域的RNA支架与组装结构结合，自组装之后形成纳米管最终形成一维RNA支架,先将带一个蛋白适配体域的结构进行自组装，再加入带另一个蛋白适配体域的结构，再进行自组装，最终形成二维RNA支架,RNA支架的形成,荧光互补实验表明，二维RNA支架在细胞中形成稳定的约100nm的球形结构，使融合蛋白能够近距离聚集。利用RNA支架进行氢酶和铁氧化还原蛋白的共定位，使氢气产量提高了约48倍,RNA干扰,RNAinterference的发现,早在1990年，Jorgensen等在研究如何增加矮牵牛花的颜色时，观察到一种无法解释的现象：通过添加过量色素基因拷贝来增加植物花的着色，结果事与愿违，不但花未着色，反而部分花变为白色。进一步的试验表明，这些导入的基因不仅不表达，反而使植物本身的基因表达也受到了抑制，即所谓的共抑制,法尔和梅洛则首次在线虫身上揭示，基因“沉默”的原因在于RNA干扰。实际上，法尔在接受诺贝尔奖网站采访时提到，第一个在线虫中观察到(RNA干扰)这种特别现象的是康奈尔大学研究生郭苏。1995年，从复旦大学毕业后赴美的郭苏在坎菲斯(KennethKemphues)指导下，试图阻断秀丽新小杆线虫的某个基因时，意外地发现反义和正义这两种单链RNA都阻断了该基因的表达。1998年，卡耐基研究院AndrewFire的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是微量双链RNA（污染）。是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰。（RNAinterference,RNAi）。,可惜的是，郭苏和坎菲斯一直没能解释这个奇怪现象。直到3年后，法尔和梅洛才揭开了谜底：在郭苏的实验中，体外转录所得RNA污染了微量的双链RNA，而经过纯化的双链RNA能够高效率地阻断相应基因的表达。这就是RNA干扰。郭苏后来到加州大学旧金山分校（UCSF）任职。她说：“他们在我们工作的基础上，解释了我们那个让人迷惑的现象，是一个飞跃我和坎菲斯通过话，我们的工作在这个奖项中有所贡献，我们为此感到自豪，也都认为安德鲁法尔和克雷格理应获奖。”启示：在实验时，要认真观察每个现象，发现怀疑并给予证明，不要被误导。,RNAi现象的普遍性,RNAi现象广泛存在于线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。,RNA干扰的机理,参与RNAi反应的酶Dicer酶：是RNA酶家族的一个成员。RNA酶是一种能切割双链RNA的酶。Dicer酶参与RNAi反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶结构域，一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（shortinterferenceRNA），它启动了细胞内的RNAi反应。,RdRP：细胞内存在RNAi效应的扩增系统。能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directedRNApolymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增,Dicer,RNA诱导的沉默复合体(RISC)在RNA干扰机制中，双链RNA诱导同源RNA降解的过程依赖于RNA诱导的沉默复合体的活性。RISC由Dicer酶，Argonaute蛋白，siRNA等多种生物大分子装配而成。RISC中的Dicer具有RNAase结构域，在RNAi的起始阶段负责催化siRNA的产生，在RISC装配过程中起稳定RISC中间体结构和功能的作用；Argonaute蛋白是RISC中的核心蛋白，有PAZ和PIWI两个主要的结构域，前者为siRNA的传递提供结合位点，后者是RISC中的酶切割活性中心；siRNA是RISC完成特异性切割作用的向导，在成熟的RISC中虽然只包含siRNA一条链，但siRNA在RISC形成过程中的双链结构是保证RNAi效应的决定因素。,RNAi的反应过程1.双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；2.在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA；3.SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。4.结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。,RNAi的应用RNA干扰作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术，具有明显的优势，它比反义核酸优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景，具体可用于以下几个方面：1.基因功能分析2.研究信号传导通路的新途径3.新药物的研究与开发4.基因治疗5.其他应用RNA干扰技术自被发现以来在不断地发展中，由繁变简，近年来一些RNA干扰技术被应用于代谢工程中，并取得了一定的成果,sRNA应用在代谢工程中的应用示意图,a.筛选抑制效果最好的菌株及sRNA组合b.通过调整代谢流量提高产量,1.较高特异性：能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。2.高效性：相对少量的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制。3.可遗传性及远距离效应：RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，可传递给子一代。4.对细胞的有害性小：直接敲除某些基因可能会导致细胞失活，用RNA干扰可避免这种情况,在大肠杆菌中使用小RNA干扰基因的表达-需要蛋白的辅助,Solomon,K.V.,Sanders,2012.Metab.Eng.14,661671.,在Hfq蛋白的帮助下，sRNA与mRNA结合，抑制转录,sRNA质粒库的构建,a.模板质粒中插入表达组件(启动子、支架序列、转录终止序列)b.选择sRNA与目的基因结合序列及设计引物c.通过定向位点突变PCR，插入选择的靶标结合位点d.转入大肠杆菌中e.通过序列分析，确认合成的sRNAsf.sRNA质粒库构建完成,应用,a.筛选菌株b.筛选基因靶标c.优化和控制代谢流量d.遗传和代谢电路的调控,应用实例-在大肠杆菌中通过利用sRNA抑制翻译提高产物产量,Na,D.,Yoo,S.M.,Chung,Nat.Biotechnol.31,170174,sRNA在Hfq蛋白的帮助下与mRNA结合，mRNA不能与核糖体结合，从而抑制翻译,合成的sRNA的结构,大部分sRNAs由两部分功能序列组成：结合靶标mRNA的序列和支架序列(E.coli中大部分sRNAs中都有一个二级结构,为招募Hfq蛋白提供支架Hfq蛋白可以提高sRNA与靶标mRNA的杂交效率、稳定sRNA、促进靶标mRNA的降解),结合能越低，结合越稳定，抑制效果越好,支架的筛选,101个已知的sRNAs，筛掉：靶向结合序列未鉴定的Hfq蛋白结合序列未鉴定或者缺失的靶向不唯一的最终筛选出三个符合标准的sRNAs,C-空白对照，无sRNA-不带结合靶标mRNA序列的支架+带结合靶标mRNA序列的支架最终筛选出最优的支架MicC,不同结合区域与抑制效果的关系,结合区域的选择：1.靶标mRNA的翻译起始位点(TIR)范围内：从SD序列到下游20-30个核苷酸全部结合部分结合2.靶标mRNA的翻译起始位点(TIR)范围外抑制效果最好的D1、D2，抑制效率能达到90%以上,翻译起始位点（TIR）,具体实例一：运用sRNA干扰策略在E.coli中提高酪氨酸产量,绿色-过表达基因红色-sRNA抑制的靶标,大肠杆菌中Hfq蛋白辅助的RNA干扰,质粒4、3-4、1-4、2-4、及质粒2的两个突变体与质粒4组合，分别导入14株不同的菌中，筛选出产量最高的最优组合产量最高的是S17-1与质粒1-4的组合,质粒1:可编码带anti-csrA序列的sRNA的质粒质粒2:可编码带anti-pgi序列的sRNA的质粒质粒3:可编码带anti-ppc序列的sRNA的质粒质粒4:可编码带anti-tyrR序列的sRNA的质粒,具体实例二：运用sRNA干扰策略在E.coli中提高1.5戊二胺的产量,红色代表候选靶基因,运用sRNA对候选靶基因进行抑制，产量最高的是对murE进行抑制的体系,在大肠杆菌中使用小RNA干扰基因的表达-不需要蛋白的辅助,YapingYang,YuhengLin，MetabolicEngineering29(2015)217226,茎环结构可以增加反义RNA的结构稳定性，该结构与靶标mRNA结合，阻止其与核糖体结合，达到干扰基因表达的效果(mRNA的翻译起始区，包括RBS和起始密码子被认为是最理想的靶标),asRNA的环的长度与干扰效率的关系,研究了四种不同长度环的asRNA(100,150,200and300nt)与干扰效率的关系1.PT-空白对照，只有支架没有环pZEaseGFP-可产生asRNA的高拷贝质粒pSA-eGFP-表达报告基因GFP（绿色荧光蛋白）的低拷贝质粒结果：环长度为100nt的在6-24h的抑制效率为空白的80%，环长度为150nt,200nt,300nt,抑制效率分别为44%,5