第12章-核酸代谢

第12章核酸的酶促降解和核苷酸代谢第一节核酸的酶促降解第二节核苷酸的分解代谢第三节核苷酸的生物合成,核苷,核酸酶,核苷酸酶,核苷酶,嘌呤分解,嘧啶分解,核酸,核苷酸,戊糖,碱基,磷酸,第一节核酸的酶促降解,核苷酸是DNA和RNA的前体,是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP，GTP）,是NAD、FAD和CoA等的重要成份。在糖代谢中也有重要作用，如生成UDPG等。cAMP还是第二信使。,一、核酸酶生物体内存在着多种降解核酸的酶类，称为核酸酶，它在核酸降解和周转中起着重要作用。酶稳定、耐高温分类底物：脱氧核糖核酸酶(DNase)，核糖核酸酶(RNase)作用方式：核酸外切酶（exonuclease）核酸内切酶（endonuclease）,水解方向：35或53产物：3-磷酸产物或5-磷酸产物特异性:能否识别作用位点或二酯键两侧的碱基具有位点识别专一性的内切酶称限制性内切酶。,核酸外切酶核酸外切酶作用于核酸链的一端，逐个水解下核苷酸，是非特异性的磷酸二酯酶。,如蛇毒磷酸二酯酶是从DNA或RNA的游离3-羟基端开始，逐个水解下5-核苷酸；牛脾磷酸二酯酶则从游离5-羟基端开始，逐个水解下3-核苷酸。,2核酸内切酶核酸内切酶特异地水解多核苷酸内部各键，是特异性强的磷酸二酯酶。如牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯键，生成嘧啶核苷-3-磷酸或末端为嘧啶核苷-3-磷酸的寡核苷酸。,牛胰核酸酶专一作用于RNA，对DNA及其它磷酸二酯化合物不作用或作用活性很低。牛胰RNase具有高度热稳定性。许多RNAase也都是如此。牛胰RNase(RNase)是最早分离纯化并结晶的第一个RNase，由124个氨基酸组成。,1957年在曲霉中分离提纯出RNaseT1，由105个氨基酸组成。专一水解鸟苷酸二酯键，产生3-GMP或以3-GMP为末端的寡核苷酸。类似的RNase从多种真菌中分离得到。,二、脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶专一水解DNA，作用方式:作为内切酶，可切断双链或单链;作为外切酶有53切割或35切割。,例如牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase)，可切割双链和单链DNA，产物为5-磷酸为末端的寡核苷酸；牛脾脱氧核糖核酶(DNase)降解DNA产生3-磷酸为末端的寡核苷酸。未发现有碱基专一性DNase，但有序列专一性，即限制性内切酶,三、限制性内切酶（P479）1979年，W.Arber,H.Smith和D.Nathans等发现某些细菌细胞内存在一类能识别一定序列并水解外源双链DNA的核酸内切酶。细菌中产生的这类具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶或限制酶，是DNA分子操作中必不可少的工具酶。,细菌除具有限制酶外，还具有一种对自身DNA起修饰作用的甲基化酶。一种限制酶和其相应的修饰酶对底物DNA的识别和作用的部位是相同的。修饰酶使该部位上的碱基甲基化，从而使限制酶对这种修饰过的DNA不再起作用。,在细胞中，限制性核酸内切酶可降解外源侵入的DNA，但不降解经修饰酶甲基化保护的自身DNA。限制酶具有很强的专一性。它们对底物DNA有特异的识别位点(或称识别序列)。这些位点的长度一般在48bp范围内。通常具有回文结构。切割后形成粘性末端或平齐末端。,环状或线状的双链DNA分子经限制酶作用后都形成线状双链DNA，每条单链的一端带有识别顺序中的几个互补碱基，这样的末端称为粘性末端。,大肠杆菌的EcoRI对DNA的识别顺序和酶作用产物的粘性末端。,限制酶的命名较为特殊。以EcoRI为例，第1个大写字母E为大肠杆菌的属名(Escherichia)的第1个字母，第2、3两个小写字母co为它的种名(coli)的头两个字母。第4个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌株。最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。,限制酶是DNA的分子剪刀，是DNA体外重组技术和进行大分子DNA分析的重要工具。如EcoRI、EcoR、Hind、PstI等。限制酶的发现对基因工程研究有极大的促进作用。目前已发现数百种可用于DNA研究的限制酶、连接酶和修饰酶等多种酶，总称为分子生物学技术的“工具酶”。,第二节核苷酸分解代谢(P381)1、核苷酸的降解核苷酸经核苷酸酶催化，水解为核苷及无机磷酸。非特异性的核苷酸酶，能作用于一切核苷酸。某些特异性强的核苷酸酶只能水解3-核苷酸或5-核苷酸，分别称为3-核苷酸酶或5-核苷酸酶。,核苷经核苷酶作用分解为嘌呤碱或嘧啶碱和戊糖。分解核苷的酶有两类核苷磷酸化酶广泛存在于生命机体中，催化反应可逆；,核苷水解酶主要存在于植物、微生物体内，只作用于核糖核苷，催化反应不可逆。戊糖和戊糖-1-磷酸可进入糖代谢分解或重新利用，嘌呤和嘧啶也可以继续分解。,2嘌呤的降解,腺嘌呤和鸟嘌呤经脱氨氧化转变为黄嘌呤再进行降解，不同种类的生物分解嘌呤碱的酶系不同。,嘌呤的分解,尿囊酸,尿酸,尿囊素,微生物,灵长类、鸟类、爬虫类以及大多数昆虫中嘌呤的最终产物为尿酸；除灵长类以外的哺乳动物、腹足类则为尿囊素；某些硬骨鱼中则尿囊素再继续分解为尿囊酸；大多数鱼类、两栖类中尿囊酸再分解为尿素和乙醛酸；海洋无脊椎动物星虫类、甲壳类则将尿素分解为氨和CO2。,体内嘌呤核苷酸的分解代谢主要发生在肝、小肠及肾中。正常生理情况下，嘌呤合成与分解处于相对平衡状态，所以尿酸的生成与排泄也较恒定。痛风病患者血中尿酸水平升高，尿酸盐过饱和而形成结晶，沉积于关节、软组织、软骨及肾，导致关节红肿疼痛、尿路结石、肾结石等。当体内核酸大量分解（白血病、恶性肿瘤等）或食入高嘌呤食物时，也会出现上述症状。,痛风病,痛风病,在植物体中也有与嘌呤降解有关的酶。如黄嘌呤氧化酶、尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酶，还发现了嘌呤的中间产物如尿囊酸等。而且降解主要在储藏或衰老组织中进行。降解物主要以尿囊酸的形式运输到幼嫩组织或根部贮存起来。,3嘧啶的降解嘧啶分解时有氨基的首先水解脱氨基。胞嘧啶首先水解脱氨基，转化为尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶经还原打破环内双键后，水解开环成链状化合物，再水解成CO2、NH3、-丙氨酸、-氨基异丁酸，后者脱氨基后进入有机酸代谢或直接排出体外。,-丙氨酸和-氨基异丁酸可继续分解代谢，-氨基异丁酸也可随尿排出体外。食用含DNA丰富的食物、经放射线治疗或化学治疗的患者，以及白血病患者，尿中的-氨基异丁酸排出量增多。,第三节核苷酸的生物合成(P383)核苷酸是核酸合成的原料，所有的生物通常都能合成各种核苷酸。合成途径有2种：从头合成：利用氨基酸、磷酸戊糖等简单的化合物逐渐掺入原子合成核苷酸。补救途径：利用核酸降解或进食等从外界补充的含氮碱基或核苷合成新的核苷酸。肝等多种组织为从头合成，脑、骨髓只能进行补救途径。一般而言，各种生物从头合成是主要途径。,一、核糖核苷酸的从头合成1、嘌呤核苷酸的生物合成20世纪50年代，利用同位素标记，以鸽肝为材料阐明嘌呤核苷酸的生物合成途径。,嘌呤环上各原子的来源,嘌呤环上第一位的N来自Asp的氨基氮，第3位和第9位的N来自Gln的酰胺氮，第2位和第8位的C来自甲酸盐，第6位的C来自CO2，第4位、第5位的碳和第7位的氮来自Gly。,生物中合成嘌呤的过程分2个阶段：先合成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，再由IMP生成AMP和GMP。特点A：嘌呤核苷酸的合成不是先形成嘌呤环，是而先合成磷酸核糖，然后逐步由谷氨酰胺、甘氨酸、一碳基团、CO2等参入原子形成嘌呤环，直接形成次黄嘌呤核苷酸，最后生成核苷酸。B：5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)是核苷酸中核糖磷酸部分的供体。C:嘌呤的各个原子是在PRPP的C-1上逐渐加上去的。,IMP的生物合成,次黄嘌呤核苷酸合成过程从5-磷酸核糖开始到IMP生成为止，共11个反应步骤：,酰胺转移酶,合成酶,脱水环化,羧化,氨基化,甲酰化,AMP,GMP,缩合,分解,甲酰化,脱水环化,在磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的作用下，PRPP和谷氨酰胺形成5-磷酸核糖胺。C-1从-构型转变为-构型在5-磷酸核糖胺的氨基位置，由甘氨酸和甲川四氢叶酸先后提供C和N原子形成甲酰甘氨酰胺，至此嘌呤环骨架的4、5、7、8、9位顺序已形成。,由谷酰胺的酰胺基提供第3位N原子，形成甲酰甘氨脒核苷酸，接着脱水闭环成5-氨基咪唑核苷酸，反应所需能量来自ATP。,由CO2、天冬氨酸、甲酰四氢叶酸先后提供六元环上的其他原子，最后脱水闭环形成次黄嘌呤核苷酸。,11,GMP和AMP的合成IMP由天冬氨酸提供氨基转移到C6位上生成AMP。IMP经过脱氢酶催化的脱氢反应，由NAD+接受脱下的氢，IMP生成黄嘌呤核苷酸(XMP)，再由谷氨酰胺提供酰胺上的氨，ATP供能，XMP转变成GMP。,腺苷酸代琥珀酸合成酶,次黄嘌呤核苷酸脱氢酶,黄嘌呤核苷酸,嘌呤核苷酸生物合成过程的阐明对于临床医学及生产实践有重要意义。在了解核苷酸合成途径的基础上，可设计有效的核苷衍生物作为治癌药物，可以指导有关核苷酸生产的菌种选育等。癌细胞内核酸的合成作用要比正常细胞旺盛得多，如果适当地抑制核苷酸的合成，就有可能抑制癌细胞的增生。,如甲基氨基蝶呤和四氢叶酸的结构很相像，对嘌呤核苷酸合成过程中第(4)、(10)两反应中的酶起竞争性抑制作用，使反应速度减慢或停止。目前在临床上已用来治疗各种急性白血病、绒毛膜上皮细胞癌、恶性葡萄胎等。,2嘧啶核苷酸的生物合成嘧啶核苷酸的合成与嘌呤核苷酸不同：先合成嘧啶环骨架，再与PRPP结合形成嘧啶核苷酸。尿嘧啶核苷酸的生物合成20世纪40年代已阐明嘧啶环合成途径。嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、PRPP和氨基甲酰磷酸等形成的。,嘧啶环上各原子的来源,用同位素标记实验证明：嘧啶环上的N3来自NH3，C2来源于CO2，其余4个原子来源于天冬氨酸。,嘧啶从头合成途径不同于嘌呤的合成，首先合成嘧啶环-乳清酸，再与核糖-5-磷酸结合为乳清酸核苷酸，然后脱羧生成尿嘧啶核苷酸。尿苷酸是所有其他嘧啶核苷酸的前体。动物中，嘧啶核苷酸合成场所是肝脏。从氨甲酰磷酸合成开始，到尿嘧啶核苷酸生成为止共需6个步骤。,限速步骤,嘧啶环,儿童有一种生长异常的遗传性疾病巨红细胞贫血症，患者排泄大量的乳清酸，这是由于患者体内乳清酸核苷5-磷酸脱羧酶和乳清酸磷酸核糖转移酶的活力较低，使得乳清酸不能合成尿嘧啶，从而影响嘧啶核苷酸的合成，进一步影响核酸合成，因此影响细胞分裂。,当用尿嘧啶核苷等嘧啶核苷来供给这些儿童食用时，贫血症可得到改善，并且乳清酸的排出减少。可能是尿嘧啶核苷经磷酸化变成UMP，然后UMP可能变为其他嘧啶核苷酸使核酸和蛋白质的合成重新恢复正常。此外增加细胞内嘧啶核苷的浓度可抑制氨甲酰磷酸合成酶使乳清酸生成减少。,胞嘧啶核苷酸的合成尿嘧啶核苷酸转变为胞嘧啶核苷酸是在核苷三磷酸的水平上进行的。在细菌中UTP直接与NH3作用产生CTP。动物组织中由Gln提供NH3，反应要有ATP供能，由CTP合成酶催化反应。,嘧啶环,A、G、C、U（RNA)A、G、C、T(DNA),胸腺嘧啶核苷酸的合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)，它由dUMP在dTMP合成酶的催化下甲基化生成。由叶酸衍生物作为一碳单位的供体和还原剂。,脱氧尿苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,二、核苷酸合成的补救途径,哺乳动物和微生物中存在许多催化嘌呤碱基和嘧啶碱基合成单核苷酸的酶，这样可以使核酸降解产物或外源补充的碱基得到直接利用。,嘌呤碱的直接利用嘌呤直接转化成核苷酸主要有两种反应：,嘌呤磷酸核糖转移酶在人类嘌呤核苷酸代谢中非常重要。在人类中的LeschNyhan综合征，这是一种与X染色体连锁的隐性伴性遗传代谢病，主要见之于男性，患者行为反常、智力迟钝、痉挛性大脑麻痹且自我毁伤。患者先天性缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。,在正常的情况下嘌呤核苷酸的从头合成和补救途径之间存在平衡，缺少补救途径会引起嘌呤核苷酸合成的增加，患者嘌呤核苷酸合成通常为正常值的200倍。嘌呤代谢严重紊乱，尿酸为正常值的6倍，血中尿酸水平升高。过多的尿酸导致肾结石和痛风。这些症状可通过别嘌呤醇对嘌呤氧化酶的抑制而得到缓解，但对自残症状无效。现在还不知道缺少补救途径为什么会造成如此严重的神经病症状。,嘧啶碱的直接利用在尿嘧啶磷酸核糖转移酶的催化下，可将尿嘧啶转变成尿苷酸。,未发现有胞嘧啶磷酸核糖转移酶，可能不能通过此途径合成胞苷酸。,在UMP的生物合成途径中，有乳清酸磷酸核糖转移酶催化乳清酸生成乳苷酸的反应。乳清酸磷酸核糖转移酶的底物除乳清酸外，许多2,4-二酮基嘧啶化合物或5-或6-取代的衍生物如胸腺嘧啶、尿嘧啶都是该酶的底物。,核苷的直接利用生物体内的核苷可直接转变成核苷酸加以利用。生物体内存在各种核苷激酶、如腺苷激酶、肌苷激酶、假尿苷激酶、尿苷-胞苷激酶，催化各种核苷生成核苷酸。,碱基也可以通过核苷磷酸化酶生成核苷，再转变成核苷酸。,1,三、核苷二磷酸、核苷三磷酸的合成在生物体内，核苷酸常以核苷二磷酸(d)NDP、核苷三磷酸(d)NTP的形式参与合成反应。它们是在(d)NMP水平上，ATP提供Pi，由相应专一的激酶催化合成的。,核苷二磷酸激酶使核苷二磷酸和核苷三磷酸相互转变，该酶的特异性很低，所有核苷二磷酸和核苷三磷酸都可以作为磷酸根的受体和供体。,四脱氧核苷酸合成(P388)2-脱氧核糖核苷酸是DNA合成的前体。它们都是由相应的核苷酸通过以氢代替2-OH基团还原得来。在某些微生物、动植物中通常是在核苷二磷酸水平上发生还原反应，而在另一些微生物如乳酸杆菌、枯草杆菌等以核苷三磷酸为还原底物。,催化核糖环的还原作用的有两种类型核糖核苷还原酶。在自然界广泛分布并存在于哺乳动物细胞中的一类酶含有非正铁血红素，它由一种以上的多肽链组成，对核苷二磷酸的还原作用有专一性。第二类酶在某些微生物中，只含有一种多肽链，需要钴胺素(维生素B12)作为辅酶，不含非正铁血红素。是在核苷二磷酸还是三磷酸水平上的还原则取决于酶的来源。,来自大肠杆菌的第一种类型的酶系包括四种蛋白质：硫氧还蛋白(thioredoxin)、硫氧还蛋白还原酶(thforedoxinreductase)以及蛋白质B1和B2。硫氧还蛋白是小分子电子传递蛋白，分子中有两个半胱氨酸残基。,硫氧还蛋白分子中的两个半胱氨酸残基，在氧化型硫氧还蛋白中半胱氨酸之间形成二硫键，在硫氧还蛋白还原酶的催化下，由NADPH供给氢而被还原为两个-SH，作为核糖核苷