植物生物技术概论和植物组织培养原理方法及胚胎培养

植物生物技术PlantBiotechnologyKexuanTang（唐克轩）SchoolofAgricultureandBiologyPlantBiotechnologyResearchCenterFudan-SJTU-NottinghamPlantBiotechnologyRPNAS；TrendsinBiotechnology；TrendsinPlantScience；PlantCell，PlantPhysiology;PlantJournal；Planta；TrensgenicResearch；PlantScience；Plantcell,TissueandOrganCulture；InvitroCellularTAG；PlantBreeding；Euphytica,etc.,1.2植物组织培养的原理和方法,植物组织培养(PlantTissueCulture)的概念植物组织培养是以植物组织和细胞培养为基础发展起来的一门学科,是植物生物技术(PlantBiotechnology)的一个重要组成部分。,植物组织培养：在无菌和人为控制外因条件下，培养、研究植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。植株培养胚胎培养植物组织培养器官培养组织培养细胞培养原生质体培养,PlantCell,TissueandOrganCultureInVitroCellularandDevelopmentalBiology-Plant(InVitro-Plant)BiologiaPlantarumPhysiologiaPlantarumPlantBreedingPlantCellReportsPlantScienceEuphyticaJournalofIntegrativePlantBiologyPlanta,RelatedJournals,1.2.1植物组织培养的发展史,1、细胞全能性（Totipotency)学说的提出植物细胞全能性是植物组织培养的基石。,什么是细胞的全能性？生物体内的细胞为什么没有表现出全能性，而是分化成不同的组织器官？基因在特定时间和空间条件下选择性表达的结果在什么条件下植物细胞表现出全能性？处于离体状态，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下克隆羊“多莉”的诞生说明了什么？,植物组织培养的发展史,这门学科的研究始于1902年德国植物学家Haberlandt，至今已有100年的历史。学科的基础是Schwann2.太高温度灭菌时会使糖焦化,可能会产生毒性;3.灭菌时间太长会使盐沉淀,同时使琼脂解聚;4.挥发性物质不能高温灭菌,否则会被破坏.,（2）过滤灭菌法原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45微孔滤器装置,使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。此法主要用于不能利用高温高压灭菌的培养基成分灭菌操作：,下列物品不能高温高压灭菌，否则会破坏结构：多糖Saccharose；Colchicine；Zeatin；GA（95%失活）；VB1、VB12、Vc、泛酸(VB5);Antibiotics；Plantextracts；Enzymes,（3）化学灭菌法主要用于植物材料的消毒，所用浓度、消毒时间因不同材料而定，应灵活运用并不断总结经验。（三）化学实验设备主要用于培养基的配制、分装与灭菌，化学试剂的配制，蒸溜水的生产，接种材料的准备、生化分析等主要设备有：实验台、水槽、凉干架、冰箱、药品柜、电炉或微波炉、天平、搅拌器、离心机、蒸溜器、pH计、各种玻璃器皿（量筒、烧杯、试剂瓶、移液管、容量瓶、三角瓶、培养皿、parafilm、滴管等）,pH计,(四)无菌操作设备首先应具备一个无菌操作室,保持清洁,装有紫外灯。室内设备：放物台、超净工作台、各种接种工具,（五）培养设备自动控温控光系统培养室培养架摇床材料培养处调温培养箱培养箱调温调湿培养箱光照培养箱（六）细胞学观察设备,组织培养中显微观察,显微镜室,倒置显微镜,普通显微镱,体视显微镱,主要设备清单,1、超净工作台2、显微镜3、培养箱4、干燥箱5、纯化装置6、冰箱7、冷冻储存器8、离心机9、天平10、高压消毒锅11、消毒器,培养箱、干燥箱,超低温冰箱,Laminarflow,摇床，用于悬浮培养、振荡培养,12、培养用器皿,13、培养操作器械,图1-3血球计数板的结构俯视；B、侧视；C、九大格；D、一大格（25中格）1、中央平台；2盖玻片,1.2.4.培养基的配制,一、培养基的种类和特点目前发展出的培养基有几十种，但常用的有MS、B5、White、N6、KM8P等。MS的无机盐和离子浓度较高，养分平衡，是目前使用最多的培养基B5的主要特点是含有较低的铵，这个成分可能对很多培养物的生长有抑制作用White的特点是无机盐数量较低，适于生根培养KM8P主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸。N6主要用于花药培养，其特点是成分简单，且KNO3和（NH4）2SO4含量高。,培养基的成分培养基中包括植物生长必需的15种营养元素和某些生理活性物质，可概括为三大类：（1）无机营养物无机元素在植物生长发育中非常重要，镁（Mg）是叶绿素分子的一部分，钙（Ca）是细胞壁的组分之一，氮（N）是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分。此外，铁（Fe）、锌（Zn）和钼（Mo）等是某些酶的组成部分。植物除了碳（C）、氢（H）和氧（O）外，已知还有12种元素对于植物的生长是必需的，它们是氮(N)、磷（P）、硫（S）、钙(Ca)、钾（K）、镁(Mg)、铁(Fe)、锰（Mn）、铜（Cu）、锌、硼（B）和铝（Al）。其中前6种元素需要的数量较大，因此称之为大量元素或主要元素。后6种元素需要的数量较小，因此称为微量元素或次要元素。按照国际植物生理学会的建议，植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素,（2）有机营养成分主要包括碳源（糖类）和维生素类。虽然大多数培养物都能合成所有必需的维生素，但合成能力有限，其数量显然不足。为了能使组织很好地生长，在培养基中常常必须补加几种维生素和氨基酸。其中硫胺素（维生素B1）一般认为是一种必需的成分。在其它各种维生素中，已知吡哆醇（维生素B6），烟酸（维生素B3），泛酸钙（维生素B5）和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况。为了促进某些愈伤组织和器官的生长，有时还使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物，如水解酪蛋白，椰子汁，玉米胚乳，麦芽浸出物，番茄汁和酵母浸出物等。最常用的碳源是蔗糖，使用浓度为2%5%。碳源除了作为植物生长发育所需的营养物质以外，另一重要的功能是调节培养基中的渗透压。,（3）植物生长调节物质主要是细胞分裂素和生长素，有时也用GA3。生长素：生长素影响到植物茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。在离体植物组织培养中，生长素被用于诱导细胞分裂和根的分化。在植物组织培养中常用的生长素有：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、PCPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）和2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）。其中IBA和NAA广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。2，4-D和2，4，5-T对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。生长素一般溶于95%酒精或0.1-1mol/L的NaOH中。,细胞分裂素：细胞分裂素影响植物细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。培养基中加入细胞分裂素，主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织形成器官，分化不定芽。比较常用的细胞分裂素有：BAP（苄氨基嘌呤）、6BA（苄基腺膘呤）、2ip（异戊烯氨基嘌呤）、KT（激动素，呋喃氨基嘌呤）和ZT（玉米素）。细胞分裂素一般溶于0.5或1mol/L的HCl或NaOH中。,3.培养基的配制母液的配制配制母液有两个好处:可减少每次配制称量药品的麻烦;减少极微量药品在每次称量时造成的误差,一般需准备四种母液:大量元素母液:可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液。配制母液时应注意：分别称量；充分溶解；注意混合秩序：Ca+应最后加入，与SO42-和HPO42-错开，以免产生沉淀；混合时要缓慢，边搅拌边混合。B）微量元素母液因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，每配1000ml培养基取10ml或1ml，注意的原则同大量元素。C）铁盐母液必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀。一般采用螯合铁，即硫酸亚铁与EDTA钠盐的混合物。一般扩大200倍，每配1000ml培养基取5ml，EDTA钠盐需用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在75-800C之间让其螯合1小时。使用螯合铁的目的：避免沉淀；缓慢不断地供应铁。,D）有机化合物母液主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.1,1,10mg,使用时根据需要量取。E）激素每种激素必须单独配成母液，其浓度为0.1,0.5或1.0mg/ml,多数激素难溶于水，配法如下：IAA、IBA、GA3先溶于少量酒精，再加水定溶至一定刻度NAA可溶于热水或少量酒精中，再加水定溶至一定刻度2，4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定溶KT和BA先溶于少量1molHCl中，再加水定溶玉米素先溶于少量95%酒精中，再加水定溶。*利用培养基粉末的直接配制：如MS、B5等（Sigma)：加激素、蔗糖等,（2）培养基的配制称出规定数量的琼脂和蔗糖，加水直到培养基最终容积的3/4，在恒温水浴中加热使之溶解。在配制液体培养基时则无须加热，因为蔗糖甚至在微温的水中也可以溶解。分别按配方逐个加入各种贮备液，包括生长调节物质和其他的特殊补加物。加蒸馏水直至培养基的最终容积。充分混合之后，用0.1mol/LNa0H和0.1mol/LHCl调节培养基的pH。一般来说，植物组织培养适合的pH值为5.8，当pH高于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂就不能很好地凝固。把培养基分装到所选用的培养容器中，每个25150mm的试管约装培养基15m1；每个150ml三角瓶约装30-50ml。封口灭菌对于不能用高压灭菌的药品来讲，经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的培养基冷却到大约60时，在超净工作台加入到培养基中，摇匀。,1.2.5.离体无菌操作技术,一、植物材料的消毒接种前必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功的根本保证。取材应注意的事项：1.从健壮株上取材,不要有伤口2.严格防治病虫3.要在晴天取,最好中午或下午取材,不要在雨天、阴天或露水未干时取材料4.最好避开选用田间材料,选用无菌苗5.若非要用田间材料,最好将材料种在大棚里(无雨水的地方)或生长箱里.,一些表面消毒剂使用方法消毒剂使用浓度消毒时间（min）次氯酸钙9%10%530次氯酸钠2%330过氧化氢10%12%515溴水1%2%210硝酸银1%330氯化汞0.1%1%210抗生素450mg/L3060对于难消毒的材料,如有茸毛的、粗糙不平的、地下部的等，在消毒前，一般先用肥皂水洗净，自来水冲净，再在70%酒精或1N盐酸中浸30再进入消毒剂，消毒剂中可加数滴吐温20，以增强消毒剂的效果。,二、无菌操作开始操作前要用70%酒精消毒手和前臂。为保证做到无菌操作，除实验中所用物品需事先消毒外，在实验中还要保持无菌操作。因此在进行实验前，要点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火。烧灼过的器械要冷却后才能使用，工作台面上的用品要放置有序、布局合理。酒精灯在当中，右手使用的物品在右侧，左手用品在左侧。工作忌忙乱而要有序；组织、细胞及培养板在未做处理和使用前，不要过早暴露于空气中，应分别使用不同吸管吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液，不能混用。用吸管、注射器进行转移液体操作时，吸管、注射器针头、不能触及瓶口以防止细菌污染或细胞的交叉污染。,三、无菌培养材料接种后应移入培养室培养，一般培养室要求非常卫生、恒温，有理想的光照控温系统，一般材料要求250C左右，晚上一般不应低于200C。,组织培养术语,愈伤组织（Callus，Calli，Calluses）：原义指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。外植体（Explant）：由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官脱分化（dedifferentiation）：一个成熟细胞转变为分生状态的过程全能性（Totipotency）：具有完整细胞核的植物细胞所拥有的形成完整植株的潜在能力再分化（Redifferentiation）：脱分化的细胞在形成植物器官或植株的过程,克隆（Clone）：在植物细胞培养中，克隆指单一细胞有丝分裂形成的细胞群体，也指通过无性繁殖而形成的植株群体。诱导（Induction）：体外培养植物材料时，细胞分裂的启动及结构、器官等的诱发体细胞克隆：由单一体细胞形成的细胞群体配子细胞克隆：由单一配子细胞形成的细胞群体灭菌与消毒：灭菌（Sterilization）指消除实验设备或材料上的所有微生物；消毒（Disinfection）：仅指消除可能造成污染或侵染的有机体。,1.3.胚胎培养,1.3.1胚培养植物胚胎培养是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术。一、胚培养的意义1、克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性，获得种间或属间杂种植物胚培养的最大用途是用以获得种间或属间杂种。在很多种间和属间杂交中，受精作用能正常完成，胚也能进行早期的发育，但由于胚乳发育不良，杂种胚最终将会夭折，因而不能形成有发芽能力的种子。在这类难以成功的杂交中，杂种胚常常具有正常生长的潜力，若把杂种胚夭折以前置于某种合适的培养基上培养，则能获得杂种植株,2.研究合子胚的胚胎发育离体培养的胚胎发育主要与三个因素有关:接种时胚体的大小,培养基的成分,接种前在胚珠中停留的长短。如果接种的是球形胚，就会形成很多不正常胚，因为胚越小，对培养基的成分越敏感；如果接种的是心形或心形期以后的胚，胚的发育与体内发育相似。,3.克服种子休眠，提早结实植物休眠从几天到几年不等。某些园艺植物如落叶树的育种和繁育工作因种子休眠期太长而受到影响。休眠的种子在给于合适的温度、氧气和湿度条件也不能萌发，而应用胚培养常常可以克服这一类种子发育上的障碍，促进胚的生长发育。通过胚的离体培养，可使休眠期缩短。苹果属的一些品种，种子播种后在土壤中需几个月才能萌发，离体培养的胚却能在48h萌发，4周内形成移植幼苗，5个月的幼苗长达1m高。,4.获得单倍体植株单倍体的产生方法很多，通过远缘杂交，结合胚培养技术是获得单倍体的有效方法之一。栽培大麦与球茎大麦进行杂交，受精作用几乎完全正常，但由于二者的细胞分裂周期不同，合子胚在经过几次有丝分裂以后，球茎大麦的染色体被淘汰，子细胞中只留下大麦的染色体，为大麦单倍体。5.缩短育种周期，提高育种效率在育种实践中，为了加快育种进程，可采用离体胚培养的方法。例如蔷薇属植物的栽培品种常需1年才能开花。从离体培养胚获得的幼苗只需23个月即可开花，而利用这种花作父本，1年内可产生2个世代，大大地提高育种进程。,6.稀有植物的繁殖(使种子无生活力或胚发育不全的植物获得后代)许多落叶果树的种子是早熟的,种子往往不育。用胚胎培养可以将不能正常萌发的种子培养出第二代植物。兰花、天麻的种子成熟时，胚只有67个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植株。椰子（Cocosnucifera）的胚乳是液体的，为液体胚乳。有一种变异类型，它们的椰子不能形成液体胚乳，取而代之的是一种柔软肥厚的组织。这些果实被称做“Makapuno”。因这种变异类型的种子不能繁殖，故“Makapuno”十分稀罕，价格非常昂贵，在菲律宾只有盛大宴会才供应这种果实。应用离体胚培养技术，将“Makapuno”的种胚进行离体胚培养已成功地由“Makapuno”种子获得了植株，且85%后代所结的果实均是“Makapuno”。,二、胚培养技术成熟胚培养：子叶期后至发育完全的胚胚培养幼胚培养：子叶期以前的具胚结构的幼小胚操作过程：取材和消毒胚的剥离接种（看护）培养,图2-1荠菜胚正常发育的各个时期(引自Raghavan，1966)(A)合子，(B)双细胞原胚，(CE)球形胚，(F)心形胚，(G)中间期，(H)鱼雷形胚，(1)拐杖形胚，(J)倒U形胚，(K)成熟胚,图2-2车轴草、百脉根和山马蟥属植物杂种胚的胚乳看护培养法(引自Williams等，1980)(AB)由出现胚乳发育障碍的胚珠中取出杂种胚；(C)一个发育正常的种内授粉胚珠，其中含有的细胞期胚乳包围着一个鱼雷形到心形期的胚，在这个时期将胚珠剖开，取出胚乳用做看护组织，(D)将正常胚挤出胚乳囊，留下一个孔状出口：(E)把杂种胚通过孔状出口嵌入到正常胚乳中,三、胚培养的影响因素1、胚龄一般说来，胚龄大小与成活率成正相关。离体胚培养时，胚的发育有以下几种可能性途径：（1）胚胎发育途径：幼胚经过心形期，再发育到鱼雷形期，进而进入子叶期，最后萌发成苗。这是幼胚培养成功的途径。（2）早熟萌发途径：幼胚从心形期发育到鱼雷形期后，不经过子叶期直接发育成苗，即跳过某一个发育阶段，这样的幼苗往往很弱小，组织不健全，且难于培养成正常的植株。,（3）产生愈伤组织：幼胚培养过程中细胞脱分化产生愈伤组织。通过幼胚培养产生的愈伤组织，经植株再生同样可得到远缘杂种。据报道，由胚培养产生的愈伤组织较其它外植体容易得到再生植株。（4）停止生长或幼胚死亡。非常小的幼胚进行培养时，接种后常遇到细胞生长停滞，如不采取一些拯救措施，幼胚细胞即死亡。,2、培养基成熟胚培养只要求含有无机营养元素、几种维生素和少量激素的基本培养基。而未成熟胚一般不能在这类简单培养基上生长，它们比成熟胚对营养的要求更为复杂，除了无机和有机营养、维生素、氨基酸、激素外，胚乳的看护对于幼胚培养十分重要。,3、培养条件温度：大多数植物的离体胚培养温度为2530。不同的植物类型对其温度要求也不相同。起源于低纬度地区的喜温植物要求较高的温度，而起源于高纬度地区的耐低温植物所需的温度相对较低。光照：光对于某些植物胚胎的生长并不很重要，但对某些植物胚却有很大影响。主要表现在光能抑制未成熟胚的早熟萌发。,1.3.2.胚珠培养,一、胚珠培养的用途成熟胚很小时，胚培养难以成功，采用胚珠培养较