第07章细菌与噬菌体的遗传分析.ppt

第七章细菌与噬菌体的遗传分析,1,到目前为止，我们所讨论的均是有减数分裂的真核生物的遗传特点，而没有核的不进行减数分裂的原核生物，如细菌、病毒等其遗传物质又是如何传递的呢？,2,第一节细菌和病毒是遗传学研究的好材料1.病毒和细菌是最具代表性的微生物病毒结构最简单，由外壳蛋白和中间遗传物质组成，无独自生活能力，必须寄生在动物、植物或细菌中,通过体内复制、包装及溶菌而繁殖。细菌病毒又称噬菌体（bacteriophage，phage）。,3,2.细菌是单细胞原核生物其遗传物质是一个大形的环状核酸分子，为方便也常常简称为染色体。请注意，这是从真核生物引用过来的名称，严格说来，它并非细胞学上的染色体，只是为了表达方便而用于细菌，一般用于细菌时无非指细菌的类似于真核生物染色体的起主要遗传作用的遗传物质，而没有结构上（真核生物染色体的结构）的意义。,4,细菌通过裂殖法而繁殖，单一细菌可在固体培养基上形成一个菌落（clone）。野生型菌株叫做原养型（prototroph）。经突变而丧失某种营养物质产生能力的菌株叫做营养缺陷型（auxotroph）。,5,6,大肠杆菌的电子显微镜照片,7,8,9,现已证明，在以无性繁殖为主的细菌和病毒的繁殖过程中，也有类似于真核生物有性生殖的过程，存在着遗传物质的交换。微生物由于其自身的生理生化特点使其在遗传学研究中有其不可替代的优越性细菌繁殖快（大肠杆菌繁殖一代只需20分钟），可在短时间内繁殖大量个体，便于建立纯系，保持大量菌体。,10,细菌一般能合成全部AA和vit，可在一定成分的简单的培养基上生长，较易得到各种营养缺陷型营养缺陷型的获得，可以说是对现代遗传学和生物化学的一大贡献，几乎所以的遗传学内容和生化代谢研究都离不开缺陷型。而真核生物体制复杂，难以获得营养缺陷型。便于精细结构的研究：由于个体小、繁殖迅速，我们能在选择性培养基上检查上亿个个体，检出少数的突变型和紧密连锁的突变位点的重组，而这在高等生物中是不可能的。,11,细菌体制简单对于一些复杂的遗传学问题如基因调控等的研究，便于入手，正如孟德尔由一个基因到第二个基因的分离研究一样，正确的研究途径一般总是由简单入手。,12,第二节细菌的遗传分析一、细菌的杂交（接合重组）通过细菌细胞的直接接触而将一个细菌（供体，donor）的遗传物质传递给另一个细菌（受体，receptor），从而实现遗传物的重组的遗传现象。,13,1.性接合现象首先是由Lederberg和Tatum证实接合实验是在大肠杆菌的营养缺陷型间进行的。微生物菌株的命名一般由描述基因功能的文字来命名，取英文词的前三个字母，右上角写上“”、“”，或“s”、“r”。如：丝氨酸缺陷型为ser,野生型为ser+。生物素缺陷型为bio，野生型为bio+。将基因符号的第一个字母大写可表示相应的表型。,14,E.coli基因组概况E.coli的染色体为闭合双链环状DNA，长约1333um。2001年10月15日完成了E.coliK12菌株的基因组全序列测定。总共4639221bp，4279个蛋白质编码基因，115个编码rRNA和tRNA的基因。（GenBank编号:U00096）,15,AmapoftheE.coligenome,showingselectedgenes.,16,菌株Ametbiothr+leu+thi,菌株Bmet+biothrleuthi,（2）1946年，Lederberg和Tatum做了如下实验,2108,108,108,2108,含五种菌种所缺的营养物质,几小时后，洗净菌体,无菌落,无菌落,若干原养型菌落metbiothrleuthi,17,几种可能解释及其分析,上述试验结果原养型菌落可能产生于：亲本菌株A或B发生了回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料互养作用；两品系间发生了转化作用；发生细胞融合，形成了异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能性而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。,18,回复突变可能性的排除,Lederbery和Tatum利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除A或B品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。因为：单基因回复突变的频率约为10-7；双基因回复突变的频率则为10-14，频率很低。但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（10-7），因此基本可以排除回复突变的可能。,19,互养作用及其排除,试验材料A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。试验方法将A、B品系混合接种在基本培养基表面；短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr与leu供B品系持续生长。结果与结论仍然出现原养型菌落。从而表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。,20,转化作用及其排除,Lederbery和Tatum曾把品系A的培养液经加热灭菌，加入到B品系的培养物中，未得到原养型菌落，表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。戴维斯(Dawis,1950)的U型管试验(结果没有得到原养型细菌)。结论：细胞直接接触是原养型细菌产生的必要条件，从而否定了转化。,a,21,异核体和杂合二倍体的可能性,出现原养型菌落的另一种可能是细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合体,将产生原养型菌落。异核体：由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成不同的两个或多个细胞核。二倍体：异核体进一步发生核融合，形二倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。,22,异核体和杂合二倍体的可能性,细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存在。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落。对试验中得到的原养型菌落的后代所进行研究表明：后代没有出现预期的性状分离现象。,23,细菌接合（conjugation）的电子显微镜照片,24,2.F因子的发现（W.Hayes的实验，1952年）,实验用的两个不同缺陷型E.coli菌株，A和B分别具有strs和strr两种基因型。实验AstrsBstrrAstrrBstrs含str的基本含str的基本培养基上生长培养基上不长,25,2.F因子的发现（W.Hayes的实验，1952年）,对此实验结果的的一个解释是：遗传物质转移具方向性，上述杂交中，A为供体，B为受体，类似于高等生物性差别，供体可看作是雄的，受体可看作是雌的。Bstrs在含str的基本培养基上的重组受到str的抑制，从Astrr转移过来的str基因不能整合到受体的染色体上，无法产生重组子。,26,那么，这种行为的不同是由什么因素引起的呢？研究证明，它是由一种叫作F因子（sexorfertilityfactor,即性因子或致育因子）的质粒（plasmid）所决定的。F因子是一种质粒（细菌中染色体以外的能独复制的环状DNA），其上有一些基因控制致育性。,27,据此，我们可将大肠杆菌分为两类：F菌：无F因子的细菌。在杂交中是受体（receptor）菌。F菌：含F因子的细菌。在杂交中是供体（donor）菌。表面有性伞毛，据此与F菌接合并使F因子从F转移到F而使F转变为F。F菌用吖黄素处理可使菌体丢失F因子而成F菌。,071105,27-28,28,杂交特点：在FF中接合完毕后，大约有70以上的F转变为F，而F在转移F因子的过程中本身并不丢失F因子，它一边复制一边转移，故杂交完毕后F菌仍为F。F因子转移过程中染色体通过接合而转移到F细菌的可能性极小，少量转移到F中的供体DNA通过交换（偶数次）与受体染色体重组，产生重组子（通过接合作用及重组作用而获得了供体DNA的受体菌）。,29,30,3.高频重组Hfr菌（高频重组菌）：F因子通过重组而整合到染色体上的菌株。HfrF特点：杂交完毕后，F几乎仍为F，但染色体基因的重组频率几乎比FF提高一千倍达104，所以Hfr菌株称为高频重组菌：Highfrequencyofrecombination。,31,4.用中断杂交技术作连锁图在HfrF交配中，供体菌染色体的一条链首先在染色体与F因子接合处断裂（F因子有方向性，断裂处恒定在F因子的某一端），这一染色体断裂点称为原点或O，从原点开始以线性方式进入受菌体，基因离原点越远，进入F细胞越迟，F因子在最后才进入F。由于染色体的全程转移约2小时左右，而这2小时的过程中由于细胞位置的游动或液体的流动等原因，两细胞间的结合随时可能中断，故越后面的基因不但在F中出现的时间越晚，而且所能得到的重组子的比例也越低，所以杂交后F往往仍是F。,32,用中断杂交技术（interruptedmatingtechnigue）作连锁图(WallmanandJacob）:用于接合杂交的菌株为：Hfrthr+leu+azirtonrlac+gal+strsFthrleuazistonslacgalstrr,33,HfrF,0min,2ml,搅拌,防止再接合,涂布,strMM,strMM,strMM,strMM,strMM,混合,MM:minimalmedium,培养后将每个皿上的菌落分别影印,喷T1strMM,加azistrMM,strlacMM,strgalMM,培养后分析各个皿上的生长情况，绘出连锁图。,2min,4min,6min,.,60min,2ml,2ml,2ml,2ml,搅拌,搅拌,分开,搅拌,搅拌,稀释,稀释,稀释,稀释,稀释,涂布,涂布,涂布,涂布,34,35,如果每隔2分钟中断一次进行涂皿，那么在1小时内我们共可获得30个培养皿。将每个培养皿分别影印到一组4个不同的选择培养基（selectivemedia）。分析Hfr中4个非选择性标记在F中出现的时间和顺序，以时间为单位，绘制出连锁图。实验室结果如下图。从图上可知，在F中出现供体非选择性标记的次序为：azirtonrlac+gal+因此我们可做出如下连锁图（时间表达了基因间的相对距离）。,36,37,12025181190,Fgallactonazi,38,Hfr的染色体呈环形用不同的Hfr菌进行中断杂交试验，都可作成连锁图。由这些实验可知，各种Hfr菌株的基因转移的起点、顺序和方向各不相同，如下图a所示的实验结果。这情况初看似乎难以理解，但仔细观察，我们可发现，各个基因的相对位置其实没变，可排列成图b这种形式,产生这种现象的根本原因是大肠杆菌的染色体是环状的。各种Hfr菌株的染色体组成如下图所示。,39,40,41,5.F因子整合到染色体的过程整合过程与真核生物的重组类似，通过一次交换使两个环状分子合二为一，形成一个较大的环状DNA分子。附加体（episome)：既可独立复制存在又可整合到染色体上的质粒。,42,F因子的组成如图：原点：转移的起始位点致育基因群：包括性伞毛基因、转移基因等。复制酶基因配对区：与染色体配对交换后插入染色体。,复制酶区域,43,6.细菌交换过程供体染色体片断进入受体后，形成部分二倍体（partialdiploid）或称部分合子merozygote,一套完整的基因组与一不完整基因组（供体外基因子，exogenote）组成的部分二倍体，供体DNA通过双变换或其他偶次交换整入受体基因组。奇数次交换产生线状不平衡染色体,菌体不能成活。重组后相反的重组子不出现。,44,7.重组作图当两基因的距离小于或约为2分钟左右时，用中断杂交技术作图就不很可靠。在实验过程中由于操作上的时间误差，这么靠近的两个基因难以通过此法得到正确可靠的距离，这时可用传统的重组作图法作图。例如：据中断杂交试验，已知lac和ade紧密连锁且lac先进入F。重组作图实验如下：,45,Hfrlac+ade+strsFlacadestrr,混合60min,mm+str,ade+strr,影印,乳糖EMBmm,46,皿上长出的菌落均为Fade+strr，由于lac在ade之前，所以Fade+strr一定来源于同时得到lac和ade的部分二倍体。将重组子影印到乳糖曙红（伊红）美蓝基本培养基（EMB培养基）上，鉴定重组子能否发酵乳糖。在此培养基上所长出的菌落，紫红色表示能发酵乳糖，粉红色表示不能发酵乳糖。若重组子为Flacade+strr，表明lac与ade之间无交换，若为Flacade+strr，表明lac与ade之间发生交换。,47,Hfrlac+ade+,F-lac-ade-,F-lac-ade-,Hfrlac+ade+,F-lac-ade-,F-lac+ade+,没有发生交换,两个基因都交换到受体上,交换发生在两个基因之间,Hfrlac+ade+,F-lac-ade-,F-lacade+,48,请问：此重组值与真核生物杂交的重组值有何不同？它的本质是什么？,重组值,lacade+,（lacade+）（lacade+）,22,49,用中断杂交作图法所得的距离为1，故1分钟大约等于20重组值。中断杂交作图和重组作图的基因距离基本上是符合的。综合这两种方法及其他实验结果，目前已绘制了大肠杆菌K12的遗传学图，包括52个准确定位的基因座位和初步定位的基因共约500600个。,50,51,8.性导Hfr菌上的F因子有时能去整合而从染色体上脱离下来，形成F。有时F因子脱离时,由于偶然发生的不规则交换，使F因子的一小段留在染色体中，而F因子本身又带有一段染色体片断（整合位点旁边的片段）。F因子：缺少一部分片断而同时又带有细菌染色体片断的F因子。F菌与F交配时，F因子以高频率将供体染色体片断带进F中，形成部分二倍体，借此可进行重组研究。,52,F因子转导（性导，sexduction):通过F因子的转移而使受体菌改变其基因性状的现象。F因子可在同一位点重新整合到染色体而恢复为Hfr，所以FF时，常常也进行供体染色体基因的高频转移，但效率比普通Hfr低。,53,二、转化（transformation）,1.转化：细菌直接从环境中吸收DNA而使自身遗传性状发生改变的现象。在细菌群体中，并非所有细胞均可被转化，能被转化的细胞只占总数的极少数。2.感受态：能吸收DNA分子而被转化的生理状态。不同的微生物出现感受态的时间和感受态持续的时间是不一样的。细菌的感受态一般出现在对数期的后期。3.转化子：被转化了的细胞。,54,4.转化过程（1）感受态的出现（2）转化因子的吸附和吸收枯草杆菌和肺炎球菌等革兰氏阳性的研究结果显示，细胞出现感受后，双链DNA吸附在细胞表面的特异性受体上，然后在DNA内切酶和外切酶的作用下，将其中的一条单链降解，另一条单链与感受态特异蛋白接合而进入细胞内。,55,56,流感嗜血菌等革兰氏阴性细菌的研究结果所显示的是另一种转化机制，转化机理如右图所示：位于细胞表面的膜结构的转化小体将吸附在细胞膜上的DNA吸收进小体中，再将DNA降解成单链，然后进入细胞。,57,（3）转化因子的整合进入细胞中的DNA不经复制，就以单链形式与受体细胞的DNA进行重组。重组的片段平均长度为8.5kb。被替代的片段随之降解。5.转化效率,1.受体细胞的感受态：它决定转化因子能否进入细胞。2.受体菌的限制系统:它决定转化因子在整合前是否被降解掉。3.受体DNA和转化因子的同源性：它决定了转化因子能否整合。,决定因素,58,第三节噬菌体的遗传分析,噬菌体：感染细菌并以细菌为宿主的病毒。噬菌体是结构最简单的生物，由核酸和周围的蛋白质构成，其大小和结构变化较多。,59,第三节噬菌体的遗传分析,一、烈性噬菌体（virulentphage）烈性噬菌体：感染宿主后经几十分钟繁殖而使细菌破裂释出子代的噬菌体。由于噬菌体极小，只能在电子显微镜下才能看到，所以噬菌体遗传学研究不能以其本身的形态特征作为研究性状，目前常用于研究的性状有：,60,1.噬菌斑的形态（plaquemorphology）噬菌斑：在长满细菌的培养皿上因噬菌体繁殖裂解形成的一个个透明圈。每个斑中，一般含有107108噬菌体，这些噬菌体由一个噬菌体繁殖而来的，相当于一个克隆，遗传上均一。因基因不同，噬菌斑或大或小，或边缘清楚或模糊等等，可作为研究对象。2.宿主范围（hostrange)：噬菌体能感染和裂解的细菌的范围。,61,62,63,二、噬菌体基因重组1.重组现象：用两种突变型噬菌体同时感染同一宿主菌，子裔可出现重组子，由此我们可进行噬菌体的重组分析。赫尔希.本兹尔（S.Benzer）用T2突变型进行了重组研究。T2中有两种突变型。,64,h（h）：宿主范围突变型，能侵染大肠杆菌B和B/2，接种到B和B/2的混合接种的培养皿上，形成透明噬菌斑。h：野生型，只能侵染B，不能侵入B/2（B/2表面能阻止T2对其吸附），在B和B/2混合接种的培养皿上形成混浊噬菌斑。,65,r：野生型，形成直径约1mm的小噬菌斑，周边有朦胧的光环。朦胧光环形成的原因：早期受噬菌体感染的细菌裂解后，形成侵染中心，噬菌体的局部浓度高，可有2个以上噬菌体同时感染一个细菌，出现溶菌阻碍(lysisinhibition）现象，使宿主菌的裂解延迟，致侵染中心的外周有裂解和未裂解的细胞，形成朦胧光环。r：快速溶菌（rapidlysis)突变型，形成2mm的大噬菌斑，且无溶菌阻碍现象，周缘清晰。,66,h+r-,h+r+,hr+,hr,67,2.重组实验：hrhr用大量hr和hr同时感染B，由于噬菌体浓度高，培养液中的B有高比例个体同时受到两种噬菌体的感染（称为混合感染或复感染现象）。实验时应尽量使宿主细胞都受到两种噬菌体的同时感染。取裂解后释出的噬菌体，接种到同时长有B和B/2的培养基上，培养后可看到4种噬菌斑。,68,4种噬菌斑,透明，小。hr半透明，大。hr半透明，小。hr透明，大。hr,亲组合重组合,重组值,重组噬菌斑数hrhr,总噬菌斑数总噬菌斑数,去掉，作为图距。,69,赫尔希曾得到快速溶菌T2的许多不同品系，以ra、rb和rc表示，它们分别与rh杂交，结果见下表：,三种不同的重组值，表示三种r的座位是不同的，可画出四种连锁图。,70,rarbrch,rarchrb,rarbhrc,rahrcrb,如何确定呢？可作下列杂交:rcrb+rcrb根据r的多少，可算出rb和rc间的重组值。实验表明，此重组值大于Rrb-h=12.3，故顺序为rchrb,71,ra在哪边?经ra与rc或杂交无法得到正确的结果，后经许多其他T2品系的研究发现，两种可能均正确，原来T2DNA也是环状的。T2图距总长约有1500图距单位（mapunit）。,h,rc,ra,rb,071112,29-30,72,三、溶源性细菌,1.温和phage（temperatephage）：感染细菌后，一般情况下并不使细菌破裂，与细菌形成共生关系而同步复制的噬菌体。,溶菌周期：偶尔。溶源周期：细菌象未受感染，继续增殖，大多数细菌进入此周期。,温和phage感染后可有两种增殖周期,进入溶源周期的本质是phageDNA整合进入宿主染色体，但也有一些溶源周期的噬菌体DNA以游离形态存在。,73,2.原噬菌体（prophage）：存在于寄主细菌中处于潜伏状态的phage。3.溶源性（lysogeny）：噬菌体存在于细菌中但并不立即导致溶菌的现象。4.溶源性细菌（lysogenicbacteria）：带有原噬菌体的细菌。自然状态下，溶源性细菌约以105102的概率裂解。受到辐射，诱变剂的因素诱导时，90左右的溶源性细菌可裂解。,74,75,5.溶源性细菌免疫性：溶源性细菌不能被与原噬菌体相同或近缘的噬菌体裂解或溶源化。进入细菌的噬菌体的复制被原噬菌体抑制。6.合子诱导（zygoticinduction）：Hfr（）F时，当进入受体F时，使F细胞裂解释出噬菌体，这现象叫做合子诱导。中断杂交试验证明，位于gal附近。所以在前面的基因在Hfr（）F中可出现重组子，而后面的基因由于合子诱导的作用几乎无法得到重组子。同理，F+（）F也几乎不出现重组子。,76,四、转导(transduction)转导：以噬菌体为媒介，将一细菌的基因导入另一细菌的过程。,转导分类,普遍性转导：供体DNA任何片断都可被转导的现象。特异性转导（局限性转导）：供体DNA只有一个或少数几个突特定基因可被转导的现象。,77,1.普遍性转导(generalizedtransduction)：供体菌染色体上的任何基因都可能被转移到受体菌中的转导。机理：噬菌体在供体菌中复制时，供体菌染色体断裂成小片断，噬菌体包装时将其错误包装而形成转导噬菌体，在感染受体菌时将供体DNA注入受体菌，并经重组而整合到受体菌的染色体上。,78,利用普遍性转导可测定基因间的连锁关系。由于错误包装的DNA长度有限（与噬菌体DNA大小相近），所以能测定的基因必须是相互靠得较近的几个。,79,如：供体菌thr+leu+azir,P1噬菌体感染,鉴定非选择性标记,子代噬菌体,受体菌thrleuazis,选择性培养皿,80,由此我们可推出基因顺序，如下图：,thrleuazi,请同学们设想一下，如以azi为选择性标记，则非选择标记性在转导子中出现的情况。,81,2.局限性转导(specializedtransduction、restrictedtransduction)供体菌染色体只有特定几个基因可能被转移到受菌中的转导。转导机理：如下图（Compbell模型）,82,83,转导子（transductant)：被转导了的细菌。转导子特点：缺陷溶源性：具免疫性，不能释出成熟噬菌体。dg（-defectivegal+）：带有gal的有缺陷的噬菌体。dg转导粒子约丧失25的phageDNA，但外壳完整，仍能感染细菌。一部分转导子是不稳定的，能产生gal分离子，它是部分二倍体，基因型为gal/gal。,84,作业刘祖洞p249：7、8、10、13、157.一个基因型为abcde并对链霉素敏感的E.coliHfr菌株与基因型肖abcde并对链霉素耐性的F菌株接合，30分钟后，用链霉素处理，然后从成活的受体中选出e型的原养型，发现它们的其它野生型(+)基因频率如下：a70，b，c85，d10。问a，b，c，d四个基因与供体染色体起点（最先进入F-受体之点）相对位置如何?8为了能在接合后检出重组子，必须要有一个可供选择用的供体标记基因，这样可以认出重组子。另一方面，在选择重组子的时候，为了不选择供体细胞本身，必须防止供体菌株的继续存在，换句话说，供体菌株也应带有一个特殊的标记，能使它自己不被选择。例如供体菌株是链霉素敏感的，这样当结合体(conjugants)在含有链霉素的