实验二 银耳多糖含量的测定.ppt

实验二银耳多糖含量的测定,1,一、实验目的,学习和掌握多糖含量测定的原理和方法。,2,三、实验原理,多糖在浓硫酸中水解，进一步脱水生成糖醛及其衍生物，与蒽酮（10-酮-9,19-二氢酮）反应生成蓝绿色复合物，在620nm处有最大吸收值。以标准葡萄糖溶液作标准，在620nm波长处进行比色，可计算出总糖的含量。,3,（1）糖经浓无机酸处理后，脱水生成糠醛或糠醛衍生物；,4,（2）糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸的作用下，能与蒽酮化合物反应生成有色物质。,（3）反应液颜色的深浅，反映出糖浓度的高低。,5,四、仪器、试剂与药品,试剂：0.1mg/ml的葡萄糖标准品、蒽酮试剂、蒸馏水样品液：0.5mg/ml试管、电炉、可见光分光度计、容量瓶etc.,6,五、实验操作,1、标准曲线的制作(1)加样：(2)将加好的样品混匀，沸水浴10min，室温冷却，于620nm处比色。(3)以第一管为空白，进行比色。以光密度（OD值)为纵坐标，糖的含量(g)数为横坐标，得标准曲线。,7,2.样品的准备称取适量样品，先加少量的水溶解，最后定容于50ml，至溶液浓度约为0.5mg/ml.3.样品中多糖含量的测定分别吸取0.1、0.3和0.5ml样品液，用蒸馏水补足1.00ml。加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。,8,9,六、思考题,1、根据样品液多糖含量，计算实验一中多糖的提取率。2、根据蒽酮测糖原理，设计测定化合物中淀粉量的方案。,10,注意事项：加样要求准确。,11,实验三猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶,12,一、实验目的,学习从猪胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有机溶剂分级沉淀法的应用。,13,二、简介,胃膜素：功效：一种以黏蛋白为主要成分的生物活性药物，有极强的黏附作用，可直接作用于消化道内壁，在胃及十二指肠溃疡面形成一层保护膜，减少胃酸对它的刺激，利于溃疡面的愈合；另一方面有润滑作用，使进入消化道的食物易于在消化道内移行，有利于减少某些物质对溃疡面的刺激。胃膜素临床上用于胃及十二指肠溃疡。性质描述:淡黄色或淡灰色粉末，或微小颗粒。着水胀为粘浆。显微溶状态，略带类蛋白胨臭。具有很强的粘附力。,14,胃蛋白酶：存在于动物胃液中，以无活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主细胞中，在酸性条件下，胃蛋白酶原变化成有消化蛋白质能力的胃蛋白酶。在医学上主要用于治疗消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工业上可作水解蛋白用。干燥的胃蛋白酶为白色或淡黄色粉末，引湿性强，易溶于水；对热较稳定，10010min不破坏。水溶液中，70以上破坏。,15,三、实验原理,胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主细胞集中在胃底粘膜，呈暗红色，直径约10-12厘米圆块，约100g。胃膜素是从猪胃粘膜经胃蛋白酶和盐酸消化后的上层液中，60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白质、酶等极性物质的水溶液加入与水混溶的有机溶剂，可沉淀析出。,16,四、仪器、试剂与药品,水浴锅，搅拌器，冰箱，真空干燥，盐酸，氯仿，丙酮，乙醇，离心机等。,17,四、实验操作,1.激活提取猪胃粘膜0.55Kg（5只猪肚）+水约220ml升（胃粘膜的40%），用1：1盐酸调pH2.5-3.0，45-50搅拌提取3h(在搅拌的过程中需注意不停的调节pH)。2.脱脂分层双层纱布过滤，冷却至室温，缓慢加入约55ml氯仿（胃粘膜的10%），搅拌2h，室温静置24h后，放掉底层的氯仿和杂质，上清液预冷至5以下,18,3.胃膜素分离上清液在搅拌下（同一方向，否则胃膜素会散开）缓缓加入预冷至5以下的丙酮（=0.708）至比重约0.97，捞出胃膜素，以适量的75%乙醇洗两次，真空干燥。4.胃酶的沉淀母液再加丙酮至比重约0.91，有黄色沉淀产生，离心（4,7000rpm,10min)取沉淀，70以下真空干燥。,19,实验四胃蛋白酶活力的测定,20,一、实验目的,学习和掌握以牛血红蛋白为底物的胃蛋白酶活力测定的原理和方法，掌握紫外分光光度计的使用。,21,二、实验原理,胃蛋白酶能催化水解芳香环氨基酸连接的肽键。在一定条件下，可定量催化水解牛血红蛋白产生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波长处有最大吸收，以酪氨酸为对照，可以求出胃蛋白酶活力。,22,三、仪器、试剂与药品,水浴锅，紫外分光光度计，酪氨基，盐酸，三氯醋酸，牛血红蛋白等。,23,四、实验操作,1、对照品溶液的制备：精密称取经105干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液取1mol/l盐酸溶液65ml，加水至1,000ml制成每1ml中含0.5mg的溶液，摇匀，备用。2、供试品溶液的制备：精密称取实验三提取的胃酶干粉40-60mg，用上述盐酸溶液制成每1ml中约含0.20.4U的溶液。（称本品（一般3500U/g以上）40-60mg，用上述盐酸溶液定容至100ml，再取5ml用上述盐酸溶液定容至50ml，即0.04-0.06mg/ml）。,24,3、测定方法：取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1ml，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置370.5水浴中，保温5分钟，精密加入预热至370.5的牛血红蛋白试液5ml，摇匀，并准确计时，在370.5水浴中反应10分钟。立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置370.5水浴中保温10分钟，再精密加入5三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液1ml，另1支加对照样品盐酸溶液1ml，摇匀，过滤，弃初滤液，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，按照分光光度法在275nm的波长处测定吸收度，算出平均值S和，按下式计算。每g含蛋白酶活力单位