HXY-生物制药学实验范文

实验一 碱裂解法小量制备质粒DNA（4学时）一、实验目的1. 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的广泛应用2. 学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和操作方法二、实验原理质粒（plasmid）是细菌细胞内的一种共价闭合环状DNA（简称cccDNA）分子，作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状，能传给子代并在子代细胞中保持一定的拷贝数，也可丢失及在细菌之间转移。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的载体，可通过连接外源基因构成重组体。从宿主菌中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。质粒抽提的方法很多，但原理和操作步骤都大同小异，以碱裂解法最为常用。碱裂解法提取质粒是根据质粒的cccDNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。使用SDS和强碱处理裂解细菌细胞后，在pH值介于12.012.5这个范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，然而cccDNA的氢键虽会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液将pH值恢复至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，和不稳定的大分子RNA，变性的蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来，从而可以通过离心去除。三、试剂和器材试剂1. LB液体培养基胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，调pH至7.0，高压灭菌。2. LB+Amp培养基LB液体培养基内加入50g/mL的氨苄青霉素。注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60时加入。3. 溶液（50 mM 葡萄糖,25 mM Tris-HCl, 10mM EDTA,pH8.0）称取0.3g Tris，0.37g EDTA二钠盐，用适量双蒸水溶解后用HCl调pH至8.0，定容到100mL，再加入0.99g葡萄糖。4. 溶液 （0.2 M NaOH, 1% SDS）称取0.8g NaOH和1g SDS溶于双蒸水，定容至100mL，现配现用。5. 溶液 (K+=3M, Ac=5M)取5 mM KAc溶液60mL，冰醋酸 11.5mL， H2O 28.5mL混匀。6. TE缓冲液（10mM pH8.0 Tris-HCl，1mM EDTA）称取0.12g Tris，0.037g EDTA二钠盐,加适量双蒸水溶解，用HCl调至pH8.0并定容至100mL，高压湿热灭菌，4保存备用。7. 无水乙醇和70%乙醇8. 酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1）9. RNase A（10mg/mL）称取不含DNA酶的RNase A 0.1g，溶于10mL TE中，沸水加热15min，分装后贮存于-20。材料携带质粒（pET32a质粒）的大肠杆菌器材灭菌锅、恒温摇床、离心机、微量移液器、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。四、实验步骤(一) 细菌的培养将含有质粒的大肠杆菌接种于LB+Amp液体培养基中，250 r/min，37摇床培养过夜。(二) 质粒提取1. 取1.5 mL培养液加入Eppendorf管中，5000 r/min 离心3 min。弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，手机菌体。2. 将菌体沉淀悬浮于100L溶液中，盖紧管口，充分振荡混匀，室温放置5-10 min。 3. 加入200 L新鲜配制溶液 ，盖紧管口，颠倒数次轻柔混匀 (勿剧烈震荡)，此时菌液应该变得清亮，将离心管放冰上5 min 。4. 加入150 L冰上预冷的溶液 ，盖紧管口，温和颠倒数次使混匀，此时出现白色絮状沉淀。冰上放置5-10 min 。5. 4，12000 r/min离心10 min ，将上清转至另一Eppendorf管中。6. 向上清中加入等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），反复混匀，12000 r/min离心10 min，将上清转移到另一Eppendorf管中。7. 向上清加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置15-20min。12000 r/min离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干管壁粘附的液体。8. 加入1mL 70%乙醇洗涤沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥，即得到质粒DNA制品。9. 将DNA溶于30 L TE（含有20 g/mL的RNase A）中，-20保存，备用。五、注意事项1.细菌培养过程中要求无菌操作。枪头、离心管等都需要灭菌。2.制备质粒的过程中，注意操作缓和，以避免机械剪切力对DNA的损伤。3.加入溶液III后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA被包埋在沉淀物内。4.为充分除去残余的蛋白质，可用酚/氯仿/异戊醇混合液进行多次抽提，直至两相间物蛋白沉淀。思考题1. 碱裂解法提取质粒的过程中，溶液I、II、III的作用是什么？2. 质粒提取过程中应注意哪些操作？实验二 限制性内切酶切割DNA（4学时）一、实验目的1.掌握DNA的酶切技术2.通过对质粒DNA的酶切，学会根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶，设计构建重组DNA分子二、实验原理限制性内切酶是从细菌中分离出来的一中能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，已有400余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg2+来激活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg2+外，还需ATP 等其他辅助因子的激活；切割位点和识别序列间的距离不同；有的内切酶同时具有甲基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II和III类型。II 型限制性内切酶只需要Mg2+的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。例如EcoRI 和HindIII 的识别和切口分别为：限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目；从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。质粒在细胞内有三种构型：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA；双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，完全开放成线状，简称线性DNA。三种构型的质粒DNA 在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA线状DNA 开环DNA。限制性内切酶作用的温度一般是37，反应体系中以Mg2+为唯一的辅助因子，且要求pH值在7.5左右。商品酶都保存在50%甘油溶液中，-20保存，活性一般为2-10U/L.(37温度下反应1小时，将1 g的DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位U)pET32a质粒图谱：三、试剂和器材材料：待酶切的质粒DNA样品（pET32a质粒）试剂：Bgl I 限制性内切酶10buffer：50 mM NaCl10 mM Tris-HCl(pH7.5)10mM MgCl21mM DTT(二硫苏糖醇)器材：Eppendorf管，Tip，冰盒，微量移液器，恒温水浴箱，电泳仪，电泳槽、紫外检测灯四、实验步骤1在灭菌的Eppendorf管中依次分别加入以下试剂：（注意：限制酶很昂贵，从-20取出后要置于冰盒中，吸取要使用新的Tip头，以免污染杂质，用完后尽快放回冰箱）10buffer 2L质粒DNA 2LddH2O 15LBgl I酶 1L2将反应液混匀，稍离心使管壁上的液体聚集到底部，置于37水浴中保温1h。3加入1L 0.5M EDTA（pH8.0）或. 65保温5-10min以终止反应。4进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30-45min。5在紫外灯下检测酶切效果。五、注意事项1. 基因操作学实验多为微量操作，DNA样品与限制酶的用量都极少，必须严格注意吸量的准确性。吸样时，将Tip头的尖部刚刚接触到液面时，轻轻吸取，注意不要将Tip尖全部插入溶液，这样会使Tip外壁上粘附很多样品，导致用量不准。2. 限制酶价格昂贵，因此注意不要使其污染二导致浪费。另外限制酶的保存不当也极易导致失活，因此注意在加样的最后一步才加限制酶，并且在冰上操作，且取用完后尽快放回冰箱。3. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。4. 在水浴中温育时，要将Eppendorf管盖盖紧，以防水进入管内造成实验失败。思考题影响核酸内切限制酶活性的因素有哪些？实验三 聚合酶链式反应（PCR）（4学时）一、实验目的学习并掌握PCR实验技术的原理以及操作步骤二、实验原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):模板的双链DNA在94下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板，在引物3端继续延伸合成DNA。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA扩增达106倍。PCR的特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。待扩增DNA模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的同源性序列识别并复性。本实验以实验一中制备的质粒DNA样品作为模板，利用一对引物，通过PCR反应可特异性扩增出其中一段DNA片段。三、试剂和器材材料：质粒DNA样品，引物（1对）试剂：dNTP，Taq DNA聚合酶，10PCR buffer，MgCl2，PCR专用无菌水器材：PCR仪，制冰机，微量移液器，Tip，PCR管四、实验步骤1. 按以下顺序配制PCR反应体系（50L总体积）：【注意：阴性对照不加模板，用ddH2O代替】10PCR buffer(不含Mg2 +)5L25mmol /L MgCl23L四种dNTP4L引物11L引物21LDNA模板5LddH2O30.5LTaq DNA聚合酶0.5L2. 盖紧管盖，将PCR管置入PCR仪中，按照以下程序运行：94预变性4min后开始以下循环94变性30s，49退火30s，72延伸40s，共35个循环，最后在72延伸10min，4 停止反应3. 取出5-10L PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。五、注意事项1. 在配制PCR反应体系时，要细心，注意不要多加和漏加。2. Taq DNA聚合酶存于-20冰箱，取用时应置于冰浴中，用完后及时放回冰箱。思考题1. 影响PCR反应的条件有哪些？2. 如果让你来设计一段已知DNA序列的上下游引物，应该注意哪些方面？实验四 DNA的琼脂糖凝胶电泳（4学时）一、实验目的学习并掌握DNA凝胶电泳的技术原理和操作方法，掌握识读电泳图谱的方法。二、实验原理琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。琼脂糖主要在DNA电泳中作为一种固体支持基质，可以制成各种形状、大小和孔隙度，其密度取决于琼脂糖的浓度。琼脂糖琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从100bp至近50kb的DNA片段。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。在电场中，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。长度不同的DNA分子由于受凝胶阻遏作用大小不一，迁移速度不同，从而达到有效分离DNA的目的。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带,用于以后的克隆操作。三、试剂和器材材料：PCR产物或限制性酶切产物，琼脂糖试剂：1kb DNA分子量Marker，10上样缓冲液 10mg/mL的溴化乙锭(EB):带手套小心称取1g EB，转移到广口瓶中，加100mL双蒸水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4贮存。50Tris-乙酸（TAE）缓冲液（用时稀释成1的工作浓度）：称量Tris 242g，Na2EDTA2H2O 37.2g 于1L烧杯中，加入约800mL双蒸水充分搅拌均匀，加入57.1mL的冰乙酸，充分溶解，最后加水定容至1L后，室温保存。器材：电泳装置：电泳仪、水平电泳槽、梳子、制胶槽紫外透射仪或凝胶成像仪微波炉，微量移液器，Tip，200mL锥形瓶四、实验步骤1. 取 50TAE 缓冲液20ml 加水至1000ml,配制成1TAE缓冲液，待用。2. 1.2%胶液的制备：称取0.6g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中,加入50mL TAE缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入EB溶液使其终浓度为0.5g/mL(也可不把EB 加入凝胶中,而是电泳后再用EB溶液浸泡染色),摇匀后将琼脂糖液小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入TAE缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。4. 加样：取9L DNA样品与1L 10上样缓冲液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。5. 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,接通电源。设置恒电压为80-100V开始电泳。当溴酚蓝条带移动到凝胶长度2/3时,停止电泳。6. 染色（仅适用于未加EB的胶板）：将胶板移入0.5g/mL的EB 溶液中,室温下浸泡染色20-25min。7. 观察和拍照：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。五、注意事项EB具有毒性，为强致癌性物质，操作务必小心。所有操作均在电泳专用操作台进行，戴一次性手套，并及时更换。思考题分析实验二和实验三的DNA样品所形成的电泳图谱。日本发动了蓄谋已久的侵华战争.这场侵略战争给中国人民带来了空前的灾难和损失,也给后人留下了深刻的历史血鉴of support and hanger. Cable hole plugging gaps should use qualified fireproof materials, block surface should have sufficient strength, surface appearance. When cables pass through the firewall, of lax structure of local fire safety clamps. Thermoplastics production, to comply with the process, no bubbles in the thermoplastics pipes, linear nose consistent with the core wire specifications, contact is good, no cracks, break. Tinned copper nose clean solder full exterior surface is smooth without burrs. Control cable Assembly should be fastened, dense, solid, clean, and beautiful. Secondary wiring the cable terminations should be arranged by the actual location of the device line cards, the wiring from the upper to the lower, from left to right in the order. Fixed to maintain consistent spacing between lines, flat, should be around the corner in the same location, same shape, to ensure that the wiring process neater and more elegant. 5 thermal process control measures for quality problems 5.1 control thermal duct system leakage measure to ensure that the use of electric door and actuator installation quality and equipment to the site to check its seal, acceptance, in order to fundamentally solve oil spill problems. Plant for local Panel after installation, in conjunction with the quality Department to check its overall quality, poor-quality parts replacement. Supply good quality of purchasing instrument and ovality of the guarantee instrument tubes as small as possible, selection of high quality, high precision sleeve connector. I