crispr原理解析PPT课件

.,1,CRISPR,CRISPR：是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA，实际上就是一种基因编辑器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因。系统分类：类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，类只需要一种Cas蛋白，（CRISPR/Cas9系统最为广泛）,.,2,CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。Leader一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。Repeat长度为2148bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为2672bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。,.,3,.,4,crRNA：当细菌抵御噬菌体等外源DNA（protospacers）入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来。sgRNA：CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guideRNA，由tracrRNA和crRNA两部分组成,两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。,.,5,Cas：CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，缩写为Cas。PAM：（protospaceradjacentmotif）protospacers选择自入侵DNA旁出现PAM的区域，剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区。,.,6,工作原理：crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，引导Cas9对DNA的定点切割。,.,7,.,8,第一阶段：外来DNA采集宿主通过Cas蛋白来识别外源核苷酸，使入侵细菌的短片段DNA作为间隔区序列插入到宿主的CRISPR位点。,.,9,第二阶段：CRISPRRNA的生物合成CRISPRRNA的生物合成从转录开始，接下来是初级转录产物pre-crRNA加工生成一类短的CRISPR衍生RNAs（crRNAs），每一个都包含与之前遇到的外源DNA（Spacer序列）对应的互补序列。pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，这两个RNAs可以融合成一个sgRNA。,.,10,第三阶段：靶向干扰crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。,.,11,数据：genome-scaleCRISPR-Cas9knockout(GeCKO)librarytargeting18,080geneswith64,751uniqueguidesequences.TheGeCKOv2librariesconsistofover100,000uniquegRNAsforgeneknock-outineitherthehumanormousegenome.,/gecko/?page_id=114,.,12,敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的人(胚肾细胞株)293T稳定细胞株（广州医科大学）在一个黑素瘤模型中，筛选出了涉及药物维罗非尼（Vemurafenib）耐药性的基因（麻省理工学院张峰）,.,13,CRISPR/Cas9的靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA基序（DNAmotif）的结合，这个短DNA基序通常在靶DNA的3末端发现，被称为前间区序列邻近基序（protospaceradjacentmotif，PAM）,.,14,NatronobacteriumgregoryiArgonaute（NgAgo）是一种DNA导向的可用于人类细胞基因编辑的核酸内切酶，与Cas9不同，NgAgogDNA系统不需要PAM，初步鉴定表明，该系统对导向-靶向（guidetarget）错配耐受低，且对编辑富含G+C的基因组更加有效。据介绍，Cas9只存在于原核生物中，而Argonautes几乎存在于所有的有机体中。要想与Cas9正确绑定