微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告学 院： 生命科学学院班 级： 2013级生科2班 组 长：刘 瑜 组 员：汤界世 李宇秀 于淑婷 陈洁作 郑国梁 2015年10月15日一、 实验目的1、了解采集土样的要求和方法。2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。二、 实验原理土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得放线菌。放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。三、实验材料试剂与仪器设备1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g）2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.42）其他：10ml无菌水、重铬酸钾3、仪器设备：干热高压锅、电热炉、超净工作台、生化培养箱、离心、摇床、电子天秤、采土铲、细目筛、药勺、称量纸、试管架、记号笔、打孔器、镊子、圆滤纸片、1ml吸管、无菌漏斗、培养皿、大烧杯（500ml）、涂玻棒、接种环、酒精灯、试管四、实验步骤1.1土壤样品的采集：在待测田块上，若田块面积小于50，则按对角线三点采样，否则按对角线五点采样。采样一般定于耕作层0-20cm,先除去表土1-2cm,用无菌铲采土足量充分用无菌塑料袋封装。1.2试剂与培养基的制备:（1） 高氏一号培养基配制:可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4）制备培养基。（2） 重铬酸钾抑制剂的配置（150mg/L）:称取 150mg 重铬酸钾, 分别放入灭菌三角瓶中, 加无菌水至 1L, 充分溶解后, 进行高压灭菌。（3） 含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置:吸取重铬酸钾抑制剂1 ml 与 9 ml 培养基混匀于培养皿中。1.3酸碱度对放线菌菌落生长的影响1.3.1pH为6.5的含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置 可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4）制备培养基。吸取150mg/L重铬酸钾抑制剂1 ml 与 9 ml 培养基混匀于培养皿中。使用磷酸二氢钠调节pH为6.5。1.3.2pH为8.0的含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置方法同上，使用磷酸氢二钠调节pH为8.0。1.4土样分离：1.3.1倒平板：淀粉琼脂培养基加热融化，冷却至55-60时倒；1.4.2制备系列稀释：土样室温自然风干（120摄氏度干热处理1h）碾碎过筛取5g加45ml无菌水振荡10min取0.5ml注入4.5ml无菌水的试管中此为10-1稀释液（有时也可加入10滴10%酚溶液）以此类推按梯度稀释法稀释至10-3、10-4、10-5；1.4.3涂布：从各稀释度的菌悬液中分别吸取0.1ml涂布在高氏一号的三种不同pH的两个平板培养基上，每个稀释度涂两个平板，共36个平板。1.4.4培养：将已经接种的平皿静置30min后，放入28温箱倒置培养5-7d；1.4.5划线：挑选出不同的单菌落，并在平板上进行三次划线；1.4.6再培养：将划好线的平板进行28温箱倒置培养5-7d；1.4.7纯化 ：先对放线菌菌落进行编号，再从平板中选择分离较好的放线菌菌落转接斜面（36个），并制片镜检做纯度检查，若不纯则应进一步将其做稀释平板分离或平板划线法分离直至纯培养。1.4放线菌的鉴定：1.4.1通过光学显微镜对分离出的菌落进行观察并且通过放线菌的形态特征来鉴定出放线菌（放线菌的菌落一般为圆形，菌落质地紧密表面绒状且干燥） 1.4.2通过显微镜对放线菌的孢子丝和孢子进行观察来鉴定出放线菌（放线菌的孢子丝在特定时候形成的孢子含有不同色素，成熟的孢子也有特定的颜色） 1.4.3用革兰氏染液对放线菌进行染色（放线菌是有分支状菌丝体的细菌，革兰染色为阳性，染色后放线菌与环境形成对比，能清楚地观察到放线菌的形态特征），并用已知菌大肠杆菌(阴性呈红色)和枯草杆菌(阳性呈紫色)作对照。五、注意事项1.在样品稀释时，每一次都要充分混合均匀。2.在样品稀释、稀释菌悬液接种以及纯化操作注意无菌。3.菌落计数时若一平皿菌落较多，可分区分别计数。实验用品清单：试剂：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、重铬酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、10%酚溶液、大肠杆菌、枯草杆菌。器皿：平板36个、试管