分子克隆中常用的酶PPT课件

.,1,二、分子克隆中常用的其它酶,使用好工具酶应注意：1保持反应混合液中蛋白质的浓度不小于0.1mg/ml,对维持酶在反应混合液中的稳定性十分重要。牛血清白蛋白（组分V是一种很好的可加入酶反应液中的中性蛋白质，它的使用终浓度应为0.1mg/ml。2提供合适浓度的底物，酶反应才能有效地进行。应尽量使反应在接近KM（达到酶的最大反应速度一半时的底物浓度的条件下进行。3应尽量采用最佳的反应条件，包括特定的pH值、温度及离子浓度。,.,2,（一）DNA聚合酶,最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶(E.coliDNApolymeraseI)大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(KlenowfragmentofE.coliDNApolymeraseI)T4和T7噬菌体DNA聚合酶（来源于T4和T7噬菌体感染的大肠杆菌)(T4andT7DNApolymerase)经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶热稳定DNA依赖性DNA聚合酶(ThermostableDNApolymerases)逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶(Reversetranscriptase)末端脱氧核苷酸转移酶(Terminaltransferase),.,3,SubstratesrequiredforDNAsynthesis,.,4,DiagramofthemechanismofDNAsynthesis,.,5,Three-dimensionalstructureofDNApolymeraseresemblesarighthand,.,6,Basetautomers,.,7,Proofreadingexonucleasesremovesbasesfromthe3endofmismatchedDNA,.,8,外切核酸酶的校对工作方式就像电脑键盘上的“deletekey”,只纠正最近的一个错误。这种校对功能极大地增加了DNA合成的准确性。DNA聚合酶掺入错误碱基的几率1/105外切核酸酶的校对功能降低了掺入错误碱基的几率1/107事实上一个细胞中发生突变的几率1/1010，准确性的进一步提高是由DNA复制过程中的修复作用所提供的。,.,9,由单一多肽链组成（Mr约103000），由大肠杆菌polA基因编码，可通过三个明确的功能域执行三种酶反应。,1.大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶,.,10,具有3种活性：53DNA聚合酶活性53及35外切核酸酶活性主要用途用切口平移方法标记DNA，在所有聚合酶中只有大肠杆菌DNA聚合酶I能用于此反应，因为它具有53外切核酸酶活性，可以从DNA链缺口的5端去除核苷酸，进行边切割边合成的过程。还可用于cDNA第二链的置换合成及对带有3突出尾的DNA分子进行末端标记。,.,11,Single-strandednicksareintroducedintotheDNAbytreatmentwithDNaseI.E.ColiDNApolymerase(PolI)bindstothenickorshortgapinduplexDNA,andthe53exonucleaseactivityofPolIthenremovesnucleotidesfromonestrandoftheDNA,creatingatemplateforsimultaneoussynthesisofthegrowingstrandofDNA.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,NicktranslationusingE.coliDNApolymerase,.,12,用枯草芽孢杆菌蛋白酶温和处理后，DNA聚合酶I可被切割成两个片段：较大的片段（包含326928位残基）称为Klenow片段，执行DNA聚合酶和35外切核酸酶活性。全酶的53外切核酸酶活性存在于较小的氨基端片段（1325位残基）。,From：/hbooks/genetics/biotech/enzymes,2.大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段,.,13,主要用途1补平限制酶切割DNA产生的3凹端，可用-32PdNTP进行DNA片段末端标记。2在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链。3用于DNA测序以及聚合酶链式反应。,示例：,注：标记反应中含有三种未标记的dNTP及一种标记的dNTP，根据DNA末端的序列进行选择。,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,Filling-inrecessed3terminiofDNAfragmentsusingklenowDNApolymerase,.,14,TheDNAsampleisdenaturedandsmalloligonucleotideswhichhybridizerandomlytothetemplatemoleculesareadded.Digoxigenin-11-dUTPisincorporatedintocopiedDNAbyelongationoftherandomprimersbyKlenowpolymerase.,DIGrandomprimedDNAlabeling(随机引物法标记DNA）,.,15,3.T4噬菌体DNA聚合酶：,（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）特点是具有很强的35外切核酸酶的活性，比Klenow片段强200倍，对单链DNA的作用比对双链DNA更强。主要用途1对于带有3突出端的DNA分子进行标记，首选T4噬菌体DNA聚合酶。首先利用35外切核酸酶活性切除DNA3突出尾，产生3凹端，然后在高浓度的某一放射性标记的dNTP存在下，外切降解反应与dNTP掺入3端的反达到平衡。2将双链DNA的末端转化成平端。,.,16,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,.,17,Labelingusingtheidling/turnoverfeature,通过空缺-转换反应获得的放射性标记片段可作为探针用于黏粒、质粒和噬菌体DNA的Southern分析或筛选菌落，也可用作凝胶电泳的分子量标准物。,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,.,18,特点是所催化的合成的DNA平均长度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA的平均长度大得多，在用于Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列时，具有很大的优势。T7噬菌体DNA聚合酶的35外切核酸酶活性也很强，约为大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的1000倍。没有53外切核酸酶活性。主要用途用于拷贝长段摸板的引物延伸反应。,4.T7噬菌体DNA聚合酶：,.,19,第一个被发现的热稳定DNA聚合酶是从极度嗜热的栖热水生菌Thermusaquaticus中纯化而来的，其中最早分离出来的一个是TaqDNA聚合酶。Taq基因编码一个823个氨基酸的蛋白，Mr=93.3kDa,35外切酶结构域聚合酶结构域53外切酶结构域DNA结合区1928,5.热稳定DNA依赖性DNA聚合酶,.,20,Taq和它的衍生物是耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有依赖于聚合作用的53外切核酸酶活性，它的35外切核酸酶结构域无催化活性，因此缺乏校正功能。其热稳定性是由该酶核心区的高度疏水性、静电作用力的稳定性、与溶剂分子的相互作用以及酶分子表面的脯氨酸引起的。最佳作用温度为7580，于60时聚合酶活性仅剩1/2,于37时活性仅剩1/10主要用途可用于对DNA进行测序，及通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增,.,21,热稳定DNA聚合酶的特点,.,22,逆转录酶是由逆转录病毒编码合成的。当病毒RNA包装成病毒颗粒感染新的细胞时，逆转录酶的作用是将病毒RNA基因组复制成DNA以便于病毒基因整合至宿主基因组中。逆转录酶有两种酶活性：DNA聚合酶活性在病毒的生活周期中，逆转录酶只是以RNA为模板进行复制，实际上，它可以单链RNA和单链DNA为模板，即具有RNA指导的DNA聚合酶及DNA指导的DNA聚合酶活性。RNaseH活性核糖核酸酶，其作用是从RNA-DNA杂交分子上降解RNA，例如水解链生长点附近的RNA模板。,6.逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）,.,23,PBSprimer-bindingsitePPTpolypurinetract,ThepathwayofretroviralcDNAformation,.,24,两种逆转录酶：禽源成髓细胞瘤病毒（AMV)，鼠源Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV)，编码的cDNA都已经克隆，可由大肠杆菌中分离获得。,通过RNaseH结构域缺失或点突变丧失了RNaseH活性的逆转录酶，提高了逆转录酶在标准温度下产生全长cDNA分子的能力。,.,25,示例：,53DNApolymerase,RNaseH(53and35exoribonuclease),MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,.,26,主要用途用于将mRNA转录成双链cDNA。在此反应中可用3种引物：寡脱氧胸苷1218聚体oligo(dT)1218。合成时，模板3端的序列有可能被过量拷贝，从而在cDNA中所占比例过大，这取决于逆转录酶的质量及反应条件。随机序列的寡核苷酸。旨在使用序列极为多样的一个寡聚核苷酸集群，以期至少能有一些寡聚核苷酸与模板退火并作为反转录的引物。特定序列的寡聚核苷酸，作为合成与某一段特定的mRNA相对应的cDNA的引物。,.,27,Firststrandsynthesis,Secondstrandsynthesis,.,28,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,在单链DNA或RNA模板参与下，也可用逆转录酶制备杂交用探针,UseofreversetranscriptasetogenerateprobesfromDNA(A)andRNA(B)templates,.,29,【注】逆转录酶与大肠杆菌DNA聚合酶I不同之处是不具有35外切核酸酶活性，缺乏校对功能，因此容易出错，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，大约每500个碱基会出现一个碱基的错误掺入。,.,30,末端转移酶来源于小牛胸腺，是仅存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的DNA聚合酶。在二价阳离子存在下，末端转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA分子的3羟基端。受体DNA可短至3个核苷酸。此酶强烈偏向于以带3突出端的DNA作为受体，也能在含有Co2+、Mg2+或Mn2+的低离子强度缓冲液中以带3平端或3凹端的DNA作为受体，但效率相对较低。,一组不同的3末端时，3未配对突出端3平末端3凹端末端转移酶催化模板非依赖的DNA合成，在适当的条件下可催化几百个核苷酸的加入，在几种有类似功能DNA聚合酶中效率是最高的,7.末端脱氧核苷酸转移酶,.,31,主要用途1)给载体或cDNA加上互补的同聚尾2)DNA片段的3端标记,From：/hbooks/genetics/biotech/enzymes,.,32,SP6噬菌体及T7和T3噬菌体RNA聚合酶来源于SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株，T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌(BacteriophageRNApolymerases)这三种噬菌体都能合成依赖于DNA的RNA聚合酶，该酶识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并沿此双链DNA模板起始RNA合成。三种RNA聚合酶都对其相应的启动子呈现高度的特异性，能合成任何置于适当启动子控制下的DNA的全长转录物。,（二依赖于DNA的RNA聚合酶,.,33,主要用途1）用于在体外合成大量与外源DNA一条链互补的单链RNA，可作为杂交用探针、体外翻译统中的功能性mRNA或体外剪接反应底物。当分析哺乳动物基因的转录时，放射性标记的RNA是首选探针。,From：/hbooks/genetics/biotech/enzymes,.,34,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.From：/hbooks/genetics/biotech/enzymes,InvivosynthesisofRNAbybacteriophage-encodedRNApolymerase,.,35,2）已用T7噬菌体转录系统在大肠杆菌、酵母中表达克隆化基因。将靶基因克隆于噬菌体启动子序列的下游及适当转录终止序列的上游。再将所产生的重组质粒（第一质粒）导入含有以可调控方式表达噬菌体RNA聚合酶的第二个质粒的细胞。因而，诱导聚合酶基因可导致第一个质粒中靶DNA的转录及其所编码产物随后的充分表达。T7噬菌体RNA聚合酶和启动子是大肠杆菌中应用最广泛的二元表达系统。,.,36,核酸标记技术是分子克隆中的常用技术，标记的DNA、RNA和固定长度的寡核苷酸片段可以作为试剂或探针用于多种实验，例如各种杂交技术、克隆及噬菌斑筛选等。这些实验的成功与否取决于通过各种方法如末端标记法、随机引物法、切口平移法、体外转录法及各种聚合酶链反应法将标记物顺利地引进DNA或RNA。一些方法可将标记物引入核酸分子中的特定位置（如5突出的羟基端或3端）或在核酸分子内多位点标记；可获得标记的单链产物，亦可标记双链核酸分子等，要根据需要选择合适的方法。,.,37,包括：T4噬菌体DNA连接酶(T4DNALigase)大肠杆菌DNA连接酶（已不常用）T4噬菌体RNA连接酶T4噬菌体多核苷酸激酶(PolynucleotideKinase)碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase),（三连接酶、激酶及磷酸酶,.,38,38,（来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌）催化ATP的磷酸基转移至DNA或RNA的5末端。在正向反应中，ATP的-磷酸基被转移到去磷酸化的DNA的5端。在交换反应中，过量的ATP存在时，也可将磷酸化的DNA的5端磷酸转移给ADP，然后DNA从-32PATP中获得放射性标记的磷酸而重新磷酸化。该酶催化5突出端磷酸化的速度比催化平端或5凹端快得多，在双链DNA切口或缺口处进行磷酸化的效率比单链末端的磷酸化效率要低。,1.T4噬菌体多核苷酸激酶,.,39,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ForwardandexchangereactionofbacteriophageT4polynucleotidekinase,.,40,40,用途1标记DNA5末端。示例：5pCpGpC+过量ATP-32PATPT4噬菌体多核苷二硫苏糖醇酸激酶Mg2+5pCpGpC+ADP2对准备用于连接但缺乏5磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。示例：5HOCpGpCATPT4噬菌体多核苷二硫苏糖醇酸激酶Mg2+5pCpGpC+ADP,*,*,注：铵离子是T4多核苷酸激酶的强烈抑制剂，因此在激酶处理前，DNA不要溶于含铵离子的溶液或用NH4Ac沉淀。,.,41,由T4噬菌体的基因30编码，是487个氨基酸残基组成的单体蛋白（Mr=55230)。催化相邻的核苷酸分子间5-磷酸基与3-羟基之间形成磷酸二酯键。用途1连接带匹配黏端的DNA分子。2使平端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。【注】i聚乙二醇（PEG可增强水溶液中大分子间的有效作用,可促进DNA的分子间连接，提高连接效率。ii连接反应中需要ATP。,2.T4噬菌体DNA连接酶,.,42,5pApCpGOHpApApTpTpCpGpT3TpGpCpTpTpApApOHGpCpApMg2+T4噬菌体ATPDNA连接酶5pApCpGpApApTpTpCpGpT3TpGpCpTpTpApApGpCpAp,.,43,失去磷酸二酯键的缺口35,缺失核苷酸的缺口,连接酶封闭缺口连接酶无法封闭缺口,无活性,(a)(b)(a)具有3OH和5P基团的一个缺口被DNA连接酶封闭起来(b)如果是缺失一个或数个核苷酸的缺口，DNA连接酶则不能将它封闭,DNA连接酶的活性,.,44,.,45,Cloninginaplasmidvector,.,46,1.同种限制性内切酶产物之间的连接：同一种限制酶酶切产物之间的末端是互补的，因此可以是正方向，也可以是反方向插入载体即双向插入，为防止载体自身环化，常用碱性磷酸酶（CIP处理线性的载体DNA分子，移去其末端的5磷酸基团，使其不能再被连接酶共价连接。用两种适当的限制性内切酶双酶切处理的载体与目的DNA的连接是定向的，称为定向连接（定向克隆质粒和目的DNA片段两端的酶切位点不相匹配）。,DNA片段之间的拼接方法,.,47,注：由于开环分子DNA的转化效率明显高于去磷酸化的线状DNA，理论上大多数转化子应含有重组的质粒。,碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化,.,48,注：应尽可能避免选用在多克隆位点上相距12个碱基以内的酶切位点。,外源DNA片段定向克隆,.,49,2.产生相同末端结构的不同限制酶切产物之间的连接：同尾酶处理的目的基因和载体之间进行连接，但连接后，原来的酶切位点都丧失。3.平末端DNA片段连接：平端可用T4DNA连接酶连接，其连接效率比粘端之间的连接效率要低，而且重组之后的片段便不能从原位删除下来。但因平端连接具有普适性，故极其有用。,.,50,BglII5-AGATCT-35-AGATCC-3BamHI5-GGATCC-33-TCTAGA-33-TCTAGG-53-CCTAGG-5连接后的杂合位点,.,51,SmaI识别序列为：CCCGGGEcoRV识别序列为：GATATCSmaI片段EcoRV片段5CCC+ATC33GGGTAG55CCCATC33GGGTAG5两个片段连接后的杂合位点既不能被SmaI切开，也不能被EcoRV切开。,.,52,4.不同末端结构的片段之间的连接：一般不能直接连接，可以对其进行一定的加工修饰之后再进行连接。修饰的方法有：1借助人工合成的连接子（Linker)提供黏性末端进行连接;2核酸酶S1将黏性末端消平后再连接;3用大肠杆菌DAN聚合酶I大片段将3凹端补平后再连接;4同聚物加尾法，借助末端转移酶在DNA的3端加上多聚poly(dA)、poly(dT)或poly(dG)、poly(dC)，然后借多聚的dA与dT或dG与dC之间的互补作用进行连接。,.,53,注：商品化的各种各样的接头有5末端带有磷酸基或羟基的两种形式,Cloningbyadditionoflinkerstoblunt-endedtargetDNA,.,54,示例：pCpCpGOH33GpGpCpTpApCpGpAp5Mg2+大肠杆菌DNAdNTP聚合酶IKlenow片段5pCpCpGpApTpGpCpTOH3GpGpCpTpApCpGpAp5,用KlenowDNA聚合酶补平DNA片段的3凹端,.,55,在进行外源DNA片段同载体分子的重组连接反应时，需要考虑下列三个因素：实验步骤要尽可能简单易行。连接形成的“接点”序列，应能被一定的限制性内切酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段。对转录和翻译过程中密码结构的阅读框架不发生干扰。,.,56,Weiss单位规定，37下20min内催化1nmol32P从焦磷酸根置换到,-32PATP所需的酶量为1个活性单位。供货商多使用的是“随意”单位，其依据是连接酶连接DNA黏性末端的能力。粗略估计：1个Weiss活性单位约等于60个DNA黏性末端单位（NewEnglandBiolabs公司定义）。因此，0.015Weiss单位的T4噬菌体DNA连接酶在16下30min内可使50%的用HindIII消化5g噬菌体DNA所产生的片段得以连接。,连接酶的活性单位,.,57,为获得最大效率的连接，反应体系越小越好，一般为10l。连接反应中，载体和插入的目的片段的摩尔比一般为1:1或1:3。DNA终浓度约为10ng/l。先用琼脂糖凝胶电泳检查DNA样品的大概浓度，然后计算DNA的用量。ngofvectorkbsizeofinsertinsertkbsizeofvectorvector,molarratioof=ngofinsert,举例：500bp目的片段，100ng3.0kb的质粒载体，载体与片段用1:3摩尔比100ngofvector0.5kbinsert33.0kbvector1,=50ngofinsert,连接反应的一般原则,.,58,连接反应的温度是影响连接效果的另一个重要因素，DNA片段间的连接常采用较低温度（1216和较长的时间（1224小时，目的是维持片段黏性末端间的氢键，便于连接酶的作用。,DNAfragmentswereincubatedwithdifferentamountsofligaseforvaryingperiodsoftime,thenelectrophoresedin1%agarose.,.,59,细菌碱性磷酸酶（BAP和牛小肠碱性磷酸酶（CIP均能催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸的反应。用途1在用-32PATP标记5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸。2去除DNA片段5磷酸，所产生的5羟基不再参与连接反应，以防止载体分子的自身环化。3）作为非放射性系统中的报道酶，与配体偶联，如能与生物素化靶分子特异性相互作用的链亲和素偶联，可用于检测和定位核酸和蛋白。,3.碱性磷酸酶,.,60,【注】BAP对高温和去污剂耐受性强，在去磷酸化反应结束后，若不能完全抑制其活性，则不能保证随后的连接反应有效地进行,。CIP具有明显的优点，在蛋白酶K及或在5mmol/LEDTA存在下加热（6560min或751015min)可完全失活，去磷酸化的DNA可通过酚-氯仿抽提纯化，因此目前主要使用CIP。近年来又分离到类似的酶，如从冷血生物中分离的碱性磷酸酶（虾SAP）可供使用，在去磷酸化反应后更易灭活。,.,61,BAL31核酸酶(NucleaseBAL31)主要活性为3外切核酸酶活性，可从线状DNA两条链的3端去除单核苷酸。用于通过可控方式去除双链DNA的末端核苷酸，缩短后的分子具有多种用途，如产生缺失、对启动子或其他调控序列进行定位等。S1核酸酶(NucleaseS1)降解单链DNA或RNA，产生带5磷酸的单核苷酸或寡核苷酸，用于分析DNA：RNA杂交体的结构，打开双链cDNA合成中的发夹环，去除DNA片段中突出的单链尾以产生平端。,（四）核酸酶,.,62,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,注：逐步从靶DNA的一端或另一端删除多个寡核苷酸产生多组嵌套式突变体可用来确定功能性顺式调控元件的边界。,.,63,核糖核酸酶A（胰)(RibonucleaseA)内切核糖核酸酶，可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。用于从DNARNA或RNARNA杂合体中去除未杂合的RNA区。注意：要制备不含DNA酶的核糖核酸酶，在配置贮存液时需加热到100，15min,.,64,蛋白酶K(ProteinaseK)是枯草杆菌类的高活性丝氨酸蛋白酶，由静止培养的温和的霉菌菌种分泌产生。催化水解多肽键，对芳香类和去电荷的氨基酸多肽键的羧基端尤甚。用途消化天然蛋白，能快速灭活细胞溶液中的DNA和RNA酶，便于高相对分子质量DNA和完整RNA的分离。消化通常是在EDTA存在条件下进行,（五）蛋白水解酶,.,65,多聚酶链式反应（Polymerasechainreaction,PCR)是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。Mullis等人于1985年发明，获得了1993年诺贝尔化学奖。,第三节多聚酶链式反应（PCR）,.,66,基本原理：以分别位于待扩增DNA区段两侧的两段序列互不相同并分别与模板DNA两条链上的各一段互补的寡核苷酸为引物。反应分三步：(1)变性(denaturation)-通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；(2)退火(annealling)-随之将反应混合液突然冷却至某一温度，反应体系中摩尔数大大过量的引物DNA可与其互补的模板在局部形成杂交链；(3)延伸(extension)-在DNA聚合酶、4种dNTP底物及Mg2+存在下，催化以引物为起始点的53的DNA链延伸反应。如此反复进行变性、退火和DNA合成的循环，新合成的DNA链又成为下一轮循环的模板，这一周而复始的过程每完成一个循环，基本上目的DNA就增加1倍，使介于两个引物间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2106-7拷贝,.,67,HumanMolecularBiology.RichardJ.Epstein,Thepolymerasechainreaction,.,68,PCR是一项敏感性极高的技术，即使104细胞中含有一个拷贝的待检核酸序列，也可被检测出来。PCR的特性决定了进入反应的唯一DNA必须是实验者所加的模板，所以PCR应该在一个没有DNA的环境中进行。随着PCR的广泛使用，最严重的问题是靶序列的污染，这在PCR之前就可能发生。如果不认识控制模板和PCR产物引起的污染的重要性，不采取相应的措施，PCR对你的研究只会有害，不会有益。,1防止PCR污染的重要性及措施,.,69,防止污染的措施如下：1设立空白对照，即除了不加入模板DNA外，实验的全过程都处于完全同等的条件；2隔离操作区域，样品制备及PCR反应的区域一定要与电泳检测区域分开；3试剂的配制、分装和保存的有关操作都应在无PCR产物的环境中进行，小量分装试剂，配制总反应混合液；4样品制备应按无菌操作的原则进行，避免样品间的污染；5细心操作，注意每一个细节。,.,70,1PCR反应的缓冲液Mg2+浓度：是影响反应特异性和扩增片段产率的重要因素，一般为1.52.0mmol/L，范围从0.55.0mmol/L；10mmol/LTrisCl(室温下pH=8.38.8)：主要靠其调节pH使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性；标准PCR缓冲液内含有50mmol/LKCl，它对于扩增500bp长度的DNA片段是有益的；DMSO（二甲基亚砜：可减少模板的二级结构，提高PCR反应的特异性，在扩增高GC含量的DNA模板时可以加入适量（10%)。,PCR反应的成分和作用,.,71,标准PCR反应体系中包含4种等摩尔浓度的dNTPs，dNTPs浓度应在20200mol/L。dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度下降，但可提高实验的精确型。4种dNTP在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。dNTP溶液具有较强的酸性，使用时应以NaOH将pH值调至7.07.5（公司销售的为pH8.0),分装小管，置20存放，可防止原液在冷冻与融化时损坏dNTP分子结构。,2底物(dNTPs)浓度,.,72,引物浓度一般为0.10.5mol/L（即6101231013个分子），浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增，还可增加引物之间形成二聚体的机率，均会使目的DNA合成产率下降。在整个PCR扩增体系中，引物的设计占有十分重要的地位。PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是多聚酶对引物的有效延伸。引物的精心设计其目的在于获得高产率的目的扩增产物，抑制非特异序列的扩增以及扩增DNA产物的后续操作。,3引物,.,73,引物设计一般遵循下列原则：引物长度以1825bp为宜，上下游引物的长度差别3bp；引物碱基尽可能随机分布，GC含量宜在4060%左右；引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性；引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列，这种序列可形成发夹结构，会阻止寡核苷酸核靶DNA的复性；两个引物之间尤其在3末端不应含有三个连续的互补碱基存在，引物间的微弱互补，都会导致引物间形成杂交，引发引物二聚体的形成和扩增；计算出来的两个引物的解链温度（Tm）值相差5；,.,74,引物3末端的性质非常关键，原则上碱基一定要与模板DNA配对。如果可能的话，每个引物的3末端碱基应为G或C。然而，并不推荐使用3末端有NNCG或NNGC序列的引物；引物5末端碱基并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其5末端碱基可以不与模板DNA匹配而呈游离状态。一般在引物5末端最多可以游离数10个碱基并不影响PCR反应的进行。引物设计时可以在5末端加上限制性内切酶位点或其它短的序列，由于位于DNA分子的5末端的限制性内切酶位点的切割效率比较低，所以引物应超出限制性内切酶识别位点至少3个碱基。,.,75,在2550l反应体系中，一般所需TaqDNA聚合酶的用量为0.52.5U，根据扩增片段的长短及其复杂程度（GC含量不同而有所区别。TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性,测试结果为：92.5、95、97.5下，TaqDNA聚合酶的生物半衰期分别为130分钟、40分钟和56分钟。在PCR反应中，变性温度一般为9430秒1分钟，以循环30次计算，TaqDNA聚合酶可保证PCR反应的需要。,4耐热DNA聚合酶,.,76,TaqDNA聚合酶缺乏35外切酶活性，因此，在PCR反应中如果发生某些单核苷酸的错配，这种酶是没有校正功能的。Taq聚合酶扩增的一个200bp的片段在25个循环后将有一半以上的片段带有一个以上的突变。不同来源的TaqDNA聚合酶在扩增效率，扩增片段的长度和保真度上都有差异。TaqDNA聚合酶是常规扩增小片段DNA时的首选酶类。为了得到某个基因高保真度的拷贝，就应选用具有校正功能的酶；如果要对扩增片段进行克隆，则需选用产生平端的酶。,注：将Taq和Pfu两种DNA聚合酶混合使用可以显著提高扩增效率，既具有校正功能的Pfu的高保真特性，又有Taq的高效率的特点。,.,77,TaqDNA聚合酶有类似于末端转移酶的非模板依赖的延伸性，并对A有优先选择性，使得PCR产物的两单链的3端往往带有一个非模板依赖的碱基A，给PCR产物的直接与平端载体相连接造成困难，效率很低。解决方法：（1先利用T4DNA聚合酶对PCR产物进行处理，然后再与平端载体连接，可以明显提高克隆的效率。（2在合成PCR的引物上直接引入限制性酶切点，扩增完成后再用限制酶切从而获得粘性末端而进行连接。（3目前已有商品化提供的利用dT加尾的载体专供PCR产物直接进行克隆。,.,78,注：PCR产物的简单纯化后往往还残留一些具有酶活性的TaqDNA聚合酶连同剩余的dNTP，可妨碍限制性内切酶对扩增片段的进一步剪切，影响克隆。MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,克隆化PCR产物加入限制性酶切位点,.,79,PCR片段克隆的T载体质粒图,.,80,PCR反应中对DNA模板的要求并不严格。首先对纯度要求不是十分严格，样品间没有交叉污染很重要。其次，模板用量很低，理论上102104拷贝的模板即可满足各种要求的PCR反应。*1g人单拷贝基因组DNA的靶细胞数3105，100lPCR反应体系中，加入模板量约为0.1g基因组DNA。当使用高分子量的DNA(10kb）作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增效果更好；*10g酵母DNA靶细胞数3105，摸板量10ng；*1g大肠杆菌DNA靶细胞数3105,细菌和质粒的摸板量依次是1ng和1pg。,5模板,.,81,模板的来源可以是血液（新鲜抗凝血、陈旧血块等、新鲜组织块和石蜡包埋组织、各种脱落细胞、毛发、尿样及粪便，还有从新鲜组织细胞中制备RNA模板。根据不同样品，采用不同的方法。抑制剂PCR反应体系中任何成分的过量存在都有可能成为抑制PCR反应的因素。常见的抑制剂有蛋白酶K，苯酚和EDTA。其他的一些物质，例如离子型去垢剂，肝素，血红蛋白和上样凝胶中的染料如溴酚蓝等。在许多情况下，引起扩增产率过低或者错误的扩增产物的主要原因是模板DNA中含有污染物，而模板DNA常常是唯一由研究者提供的反应成分。,.,82,变性：9095条件下，即使再复杂的DNA分子，如人基因组DNA也可变性成为单链，一般情况下先进行943分钟，然后进入循环，每次变性为9445秒。退火：复性过程采用的温度（Ta)至关重要，通常在比理论计算的引物和模板形成的杂合分子的熔解温度低35的条件下进行。温度的选择可以根据引物的长度和其GC含量确定。长度在1525bp之间，可通过公式计算得到Tm/C=4(G+C)+2(A+T)长度14bp,长达60-70bp可用以下公式Tm/C=81.5-16.6lgK+0.41(%G+C)-(675/n)在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性，退火时间设置为30秒。,6PCR反应条件的选择,.,83,降落PCR（TouchdownPCR)TDPCR是要设计一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10左右。这个策略有利于确保第一个引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于优势地位。TDPCR被看作是一种潜在的一步法找到最佳扩增条件的方法。TDPCR在引物和模板的同源性未知时尤为适用，例如：引物系根据氨基酸序列设计；或者扩增多基因家族的成员时；或者用于一个物种的同源片段相同的引物扩增另一物种的DNA。,.,84,热启动PCR把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下哪怕是最简短的时间，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR的目标是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值之后才允许反应中的一两种关键成分进入反应。一般是在第一个循环的变性温度超过80以后再加TaqDNA聚合酶。热启动主要用于下列情况：非特异扩增较为严重；反应中的模板DNA少于104个拷贝数；模板DNA复杂度非常高；多重PCR。,.,85,延伸：温度建议选择在7278之间，此时TaqDNA聚合酶具有最高活性。时间根据扩增片段的长度而定，在最适反应温度下,TaqDNA聚合酶的聚合速率约为2000bp/min,一般1kb以内的片段，用1分钟即可。循环次数：主要取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。用TaqDNA聚合酶（效率约为0.7)在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后既达到理想情况，以含有单拷贝的靶序列的哺乳动物DNA为模板，至少需要进行25个循环才能得到足够量的扩增产物。最后一次循环的延伸时间一般要保持5分钟。,.,86,平台效应：是指PCR循环的后期，合成产物到达0.31pmol水平，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦曲线。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、底物或引物等消耗、DNA聚合酶的种类和活性、以及非特异性产物的竞争等因素。平台期在PCR反应中是不可避免的，但一般在此之前，合成的目的基因片段的数量足可满足实验的需要。,.,87,反转录PCR(reversetranscriptase-PCR,RT-PCR)RTPCR是从RNA扩增cDNA拷贝的方法，对于从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库是极为灵敏与通用的方法。RT-PCR还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，测定基因表达强度，尤其是在获得的mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时可用RT-PCR方法来分析。,PCR技术的应用,.,88,.,89,RT-PCR一定要避免从基因组DNA扩增的信号寡核苷酸引物设计尽可能根据靶RNA的不同外显子的序列结构来设置结合位点，并应用正义与反义引物来扩增cDNA产物。用这种方法可以很容易地把来源于cDNA的扩增产物和来源于污染的基因组DNA的扩增产物区分开用内含子很少的基因的转录本做模板时，RNA样品最好用没有RNase的DNase来处理。,.,90,实时PCR(Real-timePCR),实时PCR是将PCR技术与荧光标记分子和计算机辅助软件相结合，其特点是可以在扩增DNA的同时，通过监测每一个循环周期荧光信号的变化，进行实时分析，定量的计算出样本中被扩增序列的初始DNA分子数。,.,91,Fluorescencefromhybridizedprobe,Real-timePCRresponsecurves,CT值：C代表Cycle，T代表threshold，其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,.,92,Real-timePCRstandardcurve,.,93,SYBRGreenI荧光染料可以特异的插入双链DNA中发射荧光，随着PCR的每一次循环荧光强度不断增加，当荧光强度达到设定的域值时可以定量求出所需的循环数即CT值。应用SYBRGreenI的检测灵敏度是起始样品中模板DNA的拷贝数为10100。,Roche,.,94,由于SYBR可以插入PCR产生的任何双链DNA，无法区别非特异扩增产物和引物二聚体DNA，因此质量控制的重要方面就是要进行熔解曲线的分析，一对引物扩增的所有样品的PCR产物其熔解曲线应该相同。如果熔解曲线不同则提示有PCR污染、非特异扩增或引物二聚体存在。,.,95,SERIESOF10-FOLDDILUTIONS,.,96,.,97,TaqMan荧光探针：针对待扩增的目的基因合成一序列特异的探针，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报