酶免疫测定技术分析PPT课件

1,.,酶免疫测定技术,郭先锋山西医科大学第二医院检验科,.,2,一.免疫凝集试验二.免疫沉淀试验三.免疫电泳试验四.放射免疫试验五.荧光免疫试验六.酶免疫试验七.化学发光免疫试验八.固相膜免疫分析技术九.免疫组织化学技术十.流式细胞分析技术十一临床免疫检验的自动化十二生物芯片技术（免疫测定的集成化和微型化）,临床免疫检验技术,.,3,免疫凝集试验,直接免疫凝集试验玻片法？试管法？间接免疫凝集试验类型正向间接免疫凝集试验反向间接免疫凝集试验间接免疫凝集抑制试验协同免疫凝集试验常用的间接免疫血凝试验举例？颗粒免疫凝集试验胶乳颗粒凝集试验举例？明胶颗粒凝集试验举例？炭颗粒凝集试验举例？甲苯胺红颗粒凝集试验举例？,.,4,直接凝集反应玻片法：ABO血型鉴定试管法：肥达试验,颗粒性抗原,抗体（凝集素）,.,5,正向间接凝集反应如：类风湿因子的检测,可溶性抗原,载体颗粒,抗体（凝集素）,.,6,反向间接凝集反应,抗体,可溶性抗原,载体颗粒,.,7,免疫沉淀试验,液相免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验透射免疫比浊试验散射免疫比浊试验凝胶内免疫沉淀试验免疫扩散试验（单扩，双扩）免疫电泳技术（对流免疫电泳，火箭免疫电泳，免疫区带电泳，免疫固定电泳）,.,8,液相内沉淀反应,絮状沉淀反应,环状沉淀反应如法医学血迹鉴定,+,+,抗血清,抗原,抗原,抗体,.,9,凝胶内沉淀反应,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,.,10,标记免疫技术,标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（常用标记物：放射性核素、荧光物质、酶、化学发光剂、胶体金等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，这种免疫技术称标记免疫技术,.,11,标记免疫技术的分类,一、按测定用途分类：1、免疫组化技术2、免疫测定技术二、按标记物分类：1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、发光免疫技术5、金免疫技术,.,12,主要的免疫标记物,类别标记物用途荧光素FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定125I、131I酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定,.,13,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,三大经典标记技术,.,14,酶免疫试验概述：1.将试剂抗原或试剂抗体用酶进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的酶，这种免疫技术，称为酶标记免疫技术。2.分类：酶免疫组化技术酶免疫测定技术均相法异相法固相酶免疫试验液相酶免疫试验均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法需分离复合物与游离标记物后测定临床上最常用的固相酶免疫试验是ELISA和免疫印迹,.,15,酶联免疫吸附试验(ELISA),ELISA的原理和类型一、基本要求：1.使Ag(或Ab)结合到某种固相载体（？）表面，并保持免疫活性。免疫吸附剂2.使Ag(或Ab)与某种酶结合，既保持免疫活性，又有酶的活性。酶结合物3.标本、酶标记物能按一定的次序与固相载体表面的Ag(或Ab)结合，加入酶的底物后能产生有色反应。底物,.,16,二、必备试剂：固相的Ag或Ab-免疫吸附剂酶标记的Ab或Ag-结合物酶反应的底物-底物三、方法类型：夹心法（双抗体或双抗原）间接法检测抗体竞争法测抗体或抗原捕获法测IgM抗体,.,17,3.竞争法AgAgAb+AbAg(标本)(定量)AgAb,E,E,终止液,标本,酶标抗体,底物,显色,显色,固相,固相,标本,酶标二抗,底物,1.夹心法,2.间接法,.,18,4捕获包被法测抗体IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。,.,19,特点一：灵敏性该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml。,.,20,特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。,.,21,ELISA的技术要点一、试剂制备免疫吸附剂酶标记抗原或抗体二、反应条件的选择酶标二抗浓度选择包被抗原浓度的选择三、操作标准化,.,22,一、试剂制备：免疫吸附剂固相载体要求：吸附力强能保持Ag或Ab活性不参与化学反应孔间性能一致或十分接近载体性能检查载体材料：+、-结果差别大ELISA板：10ug/LIgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV5%):校准加样器，或更换加样器2.洗涤不均匀或留有气泡:洗涤时应将气泡用洗耳球吹去3.试剂未混匀:混匀4.酶标仪质量问题或预热不够:选用高质量的仪器,预热充分,按仪器操作手册操作.,.,44,ELISA出现的问题和解决办法,5.试剂盒未平衡至室温:(平衡至室温)6.温育温度不平衡:温育温度平衡,严格按标准化操作条件进行.阴性对照显色过深:1.试剂污染;更换试剂2.洗涤不充分:延长洗涤时间,增加洗涤次数3.对照交叉污染:重复进行试验,.,45,18.05.2020,临床常用免疫学检查,45,临床常用免疫学检查,免疫功能检查自身免疫检测感染免疫检测肿瘤标志物检测(tumormarker)器官与骨髓移植的检测病毒肝炎血清标志物其它如生殖免疫检测等等,.,46,欢迎批评指正,.,47