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文档简介

.,目的基因的功能验证,减弱该基因在细胞内的作用基因敲除RNAi增强该基因在细胞中的作用基因的过量表达,.,基于同源重组的方法,.,针对单细胞微生物小鼠,.,正负双向筛选法,正选择标记抗生素抗性基因负选择标记致死基因tk将无毒的核酸类似物（GANC）转变为毒性物质,.,完全基因敲除的弊端,基因完全失活，对于看家基因来说，该基因缺失的突变往往具有致死效应，突变体不易存活改进：条件基因敲除，实现基因敲除在空间和时间上的可控性,.,空间上的可控（组织特异性敲除）,loxP位点：一段34碱基的特定DNA序列，具有方向性Cre重组酶：介导loxP位点发生重组的酶,.,Cre-LoxP系统的基因敲除,.,构建条件基因打靶小鼠：将靶基因两端锚定上同向的LoxP位点构建组织特异性Cre转基因鼠将上述两小鼠杂交，得到组织特异性基因敲除小鼠,.,时间上的可控性,用可诱导的启动子调控Cre重组酶的表达加入诱导物之后，启动子才具有活性,.,针对DNA上的靶位点，根据其两侧序列设计两个锌指蛋白分子,.,CRISPR-Cas9,在CRISPR/Cas系统里，短片段的外源DNA分子转录为crRNA,与tracrRNA结合，介导了序列特异性的切割作用，最后在Cas蛋白的作用下使靶标基因发生突变,.,反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，可直接与mRNA形成双链RNA。由于核糖体不能翻译双链RNA，所以反义RNA可抑制该mRNA的翻译。,.,如何操作？1.向细胞内转化双链RNA分子（转化上的难度，不能稳定遗传）2.向细胞内转化DNA分子，转录后成为双链RNA3.将2个DNA分子（分别编码靶基因的正义链和反义链），分别转入细胞4.较繁琐，如何只通过转化1个DNA分子，就能实现RNAi？,.,基因的过量表达（overexpression）,通过强启动子的驱动，使某一功能基因高于正常生理水平表达，通过检测基因过表达后对某一性状和表型造成的影响，来推测基因的功能。单细胞多
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