Native-PAGE实验方法与问题及其解答-主要内容：-分离酸性蛋白步骤

Native-PAGE实验方法与问题及其解答主要内容：分离酸性蛋白步骤分离碱性蛋白步骤问题和解答步骤非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳。酸性蛋白通常在非 变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。分离酸性蛋白工作液配制1. 40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2. 4分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4 贮存；3. 4堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6 g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4 贮存；4. 10电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144 g 甘氨酸，加水定容到1l ，4 贮存；5. 2溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，0.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20贮存；6. 10%APS；7. 0.25%考马斯亮蓝染色液:Coomassie red R-250 2.5g，甲醇450ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8. 考马斯亮蓝脱色液: 100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml3. 4分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8) 2.5ml 4. 4堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水 3.2ml6. 10%APS 35 l7. TEMED 15 l8. 10电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到1L电泳条件 :100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。染色和脱色:取出胶板于0.25%考马斯亮蓝染色液中染色约30min，倾出染色液，加入考马斯亮蓝脱色液，缓慢摇动，注意更换脱色液，直至胶板干净清晰背景。也可以用银染或者活性染色。分离碱性蛋白要用低pH凝胶系统，并使用以下缓冲液体系：1. 分离胶：0.06M KOH，0.376M Ac，pH4.3（7.7% T，2.67% C）；2. 堆积胶：0.06M KOH，0.063M Ac，pH6.8（3.125% T，25% C）；3. 电泳缓冲液：0.14M 2-丙氨酸，0.35M Ac，pH4.5将正负电极倒置，用甲基绿（0.002%）为示踪剂实验操作同分离酸性蛋白。回收 native-PAGE结束以后，采用电泳的方法进行回收，方法如下：电泳结束以后，切取部分染色，然后根据染色结果切取含有蛋白质的胶带装入处理过的透析袋中，加入适量的缓冲液，最后把透析袋放入普通的核酸电泳槽中，并在电泳槽中加入适量的缓冲液（和透析袋中的缓冲液相同），低温电泳2-3小时即可。回收蛋白所用的缓冲液一般和电泳所用的缓冲液相同。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI7）的电泳技术，分辨率通常比BN-PAGE低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此，BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN- PAGE之后出现的技术。既然CN-PAGE中没有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4，分辨率低。由此看来，CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。1.3 QPNC-PAGEQPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。1.3.1电泳缓冲液QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲系统（基于Tris-HCl和NaN3）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。尽管PH（10.00）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要置于冰箱中。1.3.2凝胶特征为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。最后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE等相比被称为“突破性的方法”。1.3.3 实验方法（1）储备液1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4（新鲜）（2）电泳缓冲液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4电泳槽上部：500ml电泳缓冲液电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液（3）洗脱液20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4洗脱室：700ml洗脱缓冲液（4）分离胶丙烯酰胺4%T 体积40ml成分：4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.0032 mL H2O200 L 10% APS20 L TEMEDAPS和TEMED最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。（5）样品的准备和收集保持样品（生物液体）温度为4。0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在4冰箱中进行。纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。1.3.4 定量和鉴定Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。1.3.5 应用QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗水平。问题和解答1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的？预电泳时要加6DNA上样缓冲液吗？电泳12小时再加结合反应产物吗？预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂，提高分辨率，不加任何物质，一般分钟后加样电泳。2. 银染的步骤是什么？银染的关键因素是什么？步骤是：（1） 固定：10%冰乙酸min。（2） 清洗：双蒸水冲洗凝胶次，每次1min。（3） 染色：染色液（1g硝酸银，.5mL37%甲醛，1L双蒸水。现配）染色30min。（4） 清洗：迅速洗凝胶次。（5） 显影：30g碳酸钠，1.5mL37%甲醛，200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。成功银染的关键因素包括：（6） 用超纯水（比如，NANOpure或Milli-Q纯化）或者是双蒸水作银染。（7） 用提供的碳酸钠或者ACS试剂级的碳酸钠。（8） 在染色后，水清洗所用时间的长短很重要，用不超过5-10秒的时间清洗胶，然后放入显色溶液中，一般在水里浸一下就好。（9） 甲醛和硫代硫酸钠（ul/1ml）在使用前，及时加入到显色液中。（10） 在使用前及时配染色液。3. 变性PAGE的上样缓冲液配方？如何准备上样的蛋白？是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性PAGE的裂解液.具有操作步骤是什么?非变性的PAGE buffer就是0.5x