日立L-8900全自动氨基酸分析仪简易标准操作规程

文件编号： 题目：日立L-8900全自动氨基酸分析仪标准操作规程日立L-8900全自动氨基酸分析仪标准操作规程一. 目的为规范日立L-8900全自动氨基酸分析仪的基本操作、维护保养、异常处理程序，防止人为操作失误，确保氨基酸分析仪正常运转，特制定本程序。二. 适用范围本程序适用于日立L-8900全自动氨基酸分析仪。三 责任1. 本程序的实施者为氨基酸分析仪操作者，各实验室负责人对本程序的实施情况进行监督。2. 日常运行及维护、定期维护、定期点检及保养由氨基酸分析仪操作者负责。四. 内容1联机（1） 打开电脑。（2） 打开L-8900主机电源。（3） 双击桌面的图标，进入1-1画面，双击图标，进入程序。1-1（4） 在菜单栏中依次点击和，出现1-2画面，单击联机。大约两分钟，初始化完毕。中Uninitialized变成Idle，图1-2变成了图1-3，各个组件可以进行控制了。初始化完毕后，分离柱的温度逐渐上升，分离柱的温度会升到50。 如果打开反应柱的柱温控制，则温度大约20分钟升到135。1-21-3 2、手动各组件控制操作（1） 泵1和泵2点击，出现2-1的画面。设置泵1，流量0.1ml/分钟，B6 100%。点击打开泵1。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。2-1点击，出现2-2的画面，设置泵2，流量0.1ml/分钟，R3 100%。点击打开泵2。泵打开后，泵的背景颜色由灰色变为黄色。2-2（2）自动进样器点击，出现2-3的画面，设置Sampler Wash不少于3次。2-3（3）分离柱柱温箱点击，出现2-4画面，设置柱温50，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-4（4）反应柱柱温箱点击，出现2-5画面，设置柱温135，设置ON，打开柱温箱。柱温箱打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-5（5）钨灯点击，出现2-6画面，设置ON，打开钨灯。钨灯打开后，背景颜色由灰色变为黄色。 2-63、编辑方法（1）Stand By 程序（a）依次点击、出现3-1-1的画面。3-1-1（b）选中，点击。再依次点击、，出现3-1-2的画面。3-1-2（c） 在设置中选中各个柱（也可以不选），其余参数默认。（d）将方法另存为Stand-By，文件名及路径均可自选。注意最好不要覆盖原来的方法，最好另存方法。（2）再生程序如同Stand By 程序，只是选中而已。将方法另存为RG。（3）分析程序（a） 如同Stand By 程序，选中，参数默认，将方法另存为Analyze。4、编辑Sequence （1）依次点击、，出现4-1画面。选中，其余参数默认。4-1（2）点击，出现4-2画面，根据需要填写各个参数（未知样品的个数、未知样品重复次数等）。4-2（3）点击，出现4-3画面，根据需要填写各个参数（标样和未知样品的第一个瓶号，增量、进样体积等）。4-3（4）点击，出现4-4画面，根据需要填写各个参数（标样品的个数、标样的重复次数等）。4-4（5）点击，出现4-5画面。4-5（6）通过复制、编辑，最终将Sequence编辑如图4-6所示。注意此时第一行是升温程序（Stand-By），第二行是再生程序（RG），两行的进样体积均为0，Run Type是Unknown，第三行是标准样品，四行起是未知样。（7）将Sequence另存为Test。5、采集数据点击Control、Sequence Run，运行Sequence Test。数据采集完后，机器自动进入清洗程序。清洗一个小时后，自动关泵，关灯，关柱温箱。6、关机点击断开连接，关闭程序，关闭主机电源。7、试剂的准备反应液R1、R2：醋酸钠(CH3COONa2H2O)、冰醋酸(CH3COOH)、茚三酮(C9H6O4)、丙二醇甲醚（CH3CH(OH)CH2OCH3）、硼氢化钠 （NaBH4）缓冲液B1到B6：柠檬酸钠(Na3C6H5O72H2O)、柠檬酸(C6H8O7H2O)、氯化钠(NaCl)、无水乙醇(C2H5OH)、氢氧化钠(NaOH)、硫代双乙醇（硫二甘醇）(S(C2H4OH)2)、苯甲醇（）、brij-35(聚氧乙烯十二烷基谜)、辛酸(C7H15COOH)试剂建议用优级纯的。8出峰情况Asp： 天门冬氨酸 Thr：苏氨酸 Ser： 丝氨酸 Glu：谷氨酸 Pro： 脯氨酸 Gly：甘氨酸 Ala：丙氨酸 Cys：胱氨酸Val： 缬氨酸 Met：蛋氨酸 Ile： 异亮氨酸 Leu： 亮氨酸Tyr： 酪氨酸 Phe：苯基丙氨酸 Lys：赖氨酸 NH3： 氨气His： 组氨酸 Trp：色氨酸 Arg：精氨酸9. 仪器使用注意事项（1）氮气压力：仪器需要的压力为0.050.1Mpa，压力过高会损坏仪器。（2）为避免堵塞，注意泵1泵2的打开顺序。先开泵1，再开泵2。泵1用B6100%，0.1ml/分钟；泵2用R3100%，0.1ml/分钟。（3）电脑严禁更改设置，严禁安装其他程序，严禁上网。注意避免染上病毒。因软件需要注册，如果操作系统发生故障，请通知天美公司。 （4）进样浓度范围：0.410 nmol， 过高的浓度会影响分析结果，且容易堵塞反应柱。（5）注意检查仪器泵的压力是否正常。（6）计划长期不用可以用B5清洗泵的流路。但最好只清洗泵头，即开泵时最好将排放阀打开。10. 样品的前处理准备想做测试的样品，在开动氨基酸分析仪之前，需要进行适合该项检测目的的处理，在这上分有两大系统，一个是将氨基酸以及和它有关连的化合物为对象对游离氨基酸的测定法（以下称生物液分析法），另一个是由蛋白质加水分解而得到的氨基酸对它的分析法（以下称蛋白质加水分解物分析法）在此对其中的几个作介绍。另外，作为原则请用0.45um的过滤器对样品过滤。（1） 生物液分析法的前处理：主要目的是做氨基酸成分的提取（萃取），除去蛋白质以及不溶性物质。（a） 血液 把血液用7,00010,000 rpm(700010000 G)离心分离15分钟 在澄清液中加入510%三氯醋酸，稀释23倍。 用7,00010,000 rpm（700010000 G）离心分离15分钟。 将澄清液作为样品。注意事项：1）澄清液有混蚀时，要么提高离心分离的转速，要么进一步使用过滤器。2）虽然三氯醋酸的浓度根据蛋白质的量而不一样，通常把添加后的浓度做为3%左右。 3）将血液就这样做除蛋白操作，回收率很低，特别是Arg的消失明显。 4）最终样品量做成0.050.1ml（b） 滤纸提取血液（直径10mm的点约30ul，最少也是直径3mm5片） 剪开滤纸，沿着离心管的管壁放入（例如： 加入0.5ml的1%三氯醋酸 用超声波清洗器震动2分钟 用7,00010,000rpm（700010000G）离心分离15分钟 用0.45um的过滤器将澄清液过滤，使用微量小玻璃瓶装进自动进样器注意事项：样品的混浊多的时候，不要使用三氯醋酸，用水/乙醇提取（萃取），待减压干硬后，用0.02N-HCI稀释的话，分析柱的污染将减少。（c） 尿 在原尿中加入1%三氯醋酸再稀释25倍（由于有异常的尿有大量的氨基酸出来，所以要提高稀释倍率）。 有混浊时，进行过滤或者离心分离。 把得到的液体的0.050.1ml作样品。注意事项：检测微量成分的良好灵敏度时，在除蛋白后，减压干硬之后用稀释液再溶解。浓度就和原液吻合。（d） 酱汁（调味汁）、果汁等含有蔬菜原料的食品类 用15%三氯醋酸溶液稀释10倍 用7,00010,000rpm（700010000G）离心分离15分钟 把澄清液作样品（e） 酱油、酒等设有沉淀物的水系食品类 在0.02NHCI稀释做样品（和PH的关系在3倍以上）注意事项：食醋等虽然在低稀释度就可以，但酱汕等由于氨基酸浓度高，要稀释200300倍左右再作样品。（f） 从植物叶的提取（萃取） 用研钵将样品搓碎，或是截断成细小状。 在含有乙醇的20%30%水中让其散开（1g样品/3ml乙醇/水） 在水浴器上用80，约20分钟以上提取（萃取）。 将澄清液过滤提取，提取（萃取）要反复3次。 使用漏斗将剩下的样品用酒精清洗。 由以及的液体在水浴器上除去酒精。 往残留下来的水溶液中加入乙醚提取（萃取）后，采取水层 把水层减压干硬 在0.02 N HCI给一定的容量（2） 蛋白质加水分解物分析法的前处理把混合了药液的氨基酸，以及用蛋白质加水分解得到的氨基酸作对象。（a） 药液 由0.02 N HCI稀释3倍以上（根据氨基酸的浓度）作样品，包含有糖、核酸、维生素等水溶性物质，也不妨碍。（b） 盐酸加水分解 将样品在加水分解用的玻璃试管上秤 加入6N-HCI 在减压状态下封管，此时，若置换N2的话，将更正确。 在加水分解炉中，用110、22小时加热分解。分解时间以上面为准，根据目的而变更。 减压干硬，除去HCI 在0.02NHCI稀释一定的容量作样品注意事项：1）最终浓度以0.5mg蛋白质/ml为标准。 2）加水分解时的容量以6NHCI1mg中，样品在3mg以下为基准。 3）减压干硬之际，在4080之间加温。（c） 以回收Trp为目的的加水分解 代替6N-HCI的是使用4N甲烷磺酸，依从前面所述，盐酸加水分解的方法让其分解。 分解后，由于不能减压干硬，加入4N-NaOH, 在PH=2调节。 在0.02N-HCI给一定的容量作样品。注意事项：1）甲烷磺酸是用1ml小玻璃瓶装入，由技术化学制品株式会社出售，其组成是在4N甲烷磺酸中含有0.2% 3-(2-氨基乙烷)吲哚氮（杂）茚 2）中和时的PH，使用PH试纸 3）分析了20个被检体后，将分解柱用再生液清洗4小时左右，这是为除去从树脂中混入到试剂的吸附物质。 4）对氢硫基乙烷磺也有效（d） 以回收Cys 、Met为目的的加水分解 精确秤量12mg样品。 加入2ml过蚁酸，在0放置424小时。 添加48%HBr0.3ml。 减压干硬。 依从盐酸加水分解的方法，减压进行到干硬为止。 加入1ml的a2N-NaOH，放置1小时。 在0.05Na1NCHI，进行PH调制和给一定的容量。 五仪器维护与保养1、样品处理 严格按照程序处理样品，特别对生理体液样品，更需小心谨慎，加沉淀剂一定要过量，离心所用时间宁长勿短，最后，一定要用0.22m超滤膜进行超滤后方可上机，以防树脂的污染和柱头的堵塞。2、缓冲液配置 缓冲液配置后首先用360目的尼龙沙网过滤缓冲液（粗滤），然后，用全玻璃的溶液过滤器装上0.45m的微孔滤膜进行超滤。配制茚三酮的缓冲液也应按上述程序进行。三是进样器洗涤液关。工作时，洗涤液要每日必换。3、管路及部件的清洗经常需要进行清洗的管路和部件是吸样泵阀及泄液管的管路。吸样泵阀的清洗步骤：将吸样泵止逆阀取下，放入超声波清洗池中，加30度左右的温水和几滴洗洁精，超声清洗1015分钟，如发现仍不干净，可将阀体拆开清洗，冲洗干净后，再组装上（注意安装方向）。吸样泵泄液管的清洗：在每次关机时，可将泄液管从阀上卸下，用玻璃注射器（50ml以上并选用适当型号的针头）先用去离子水注射清洗，再用75%乙醇注射清洗。如果管路中沉积物太多，不易清洗干净，或管路已完全堵塞，可将泄液管盘起放入超声波清洗池中，40度温水超声清洗1015分钟，边清洗边用注射器反复推和抽，使管路里面的沉积物逐渐松动，最后完全清除。必要时还可配合细铜丝等工具的使用，将沉积物捅开并清洗。在突然断电又不能在短时间内来电的情况下，为了防止反应盘管中发生堵塞，也可采用注射器注入去离水的方法清洗反应盘管。具体方法是：将混合器（三通）与反应盘管接合部卸下，选用适当型号的针头插入盘管一端，用注射器（50ml以上）注入去离水。如压力太大，可将反应盘管后部的倍压线圈拆下另行清洗。待反应液全部被去离子水置换出来后，再将管路接好。注意：1、针头必须水平插入，以防刺破反应盘管的管壁；2、凡是有塑料管连接的部位，螺帽都需适度旋紧，以防管壁变形，使阻力增大。4、分析柱的保养分析柱及去氨柱的保养分两个方面：1、样品及试剂的处理以防污染和堵塞，在前面已经提及；2、分析柱的再生。合理的再生能有效的清除树脂及