果蝇实验基础

果蝇实验基础实验时间2016.11.8晚摘要：在模式生物中，最著名、“服役时间”最长、研究最深入与广泛的当属果蝇(Drosophila)，其中遗传学和生物学研究中常用种为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。通过观察不同种类果蝇的雌雄个体，找出雌雄个体之间的差异，掌握辨别不同种类果蝇雌雄的方法，便于后期对处女蝇的挑选与雌雄果蝇的筛选和辨别。了解果蝇几种典型突变体黑檀体、残翅、三隐等个体的性状和表型，并与野生型之间进行仔细比较观察，准确地对突变体的性状进行识别，为进一步的杂交实验观察打下基础。学习和掌握果蝇培养的基本方法和操作步骤。1引言在模式生物中，最著名、“服役时间”最长、研究最深入与广泛的当属果蝇(Drosophila)，其中遗传学和生物学研究中常用种为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。果蝇是遗传学及生物学其他学科使用最广泛的模式生物，并对现代生物学的发展产生了重大的影响。这是因为果蝇作为遗传学或或生物学的研究材料具有很多突出的优点：(1)果蝇染色体数目少，D.melanogaster仅有四对染色体，基因组约180Mb，约120Mb常染色质，其他为异染色质。对143.726Mb序列进行注释发现了17215个基因1。基因数目相对少。(2)雌雄蝇易于区分。(3)具有许多自发的或诱发的可遗传性突变性状。果蝇突变量巨大，Lindsley和Zimm详细描述了4000余种基因突变，9000余种染色体重排2。(4)世代周期短。25下约10天一代；个体小易于饲养，繁殖能力强，培养费用低廉。(5)具有巨大的多线染色体。(6)雄果蝇完全连锁。(7)有丰富的人造遗传工具。(8)遗传背景清楚。2000年完成了对D.melanogaster全基因组约120Mb常染色质的测序工作3。通过观察不同种类果蝇的雌雄个体，找出雌雄个体之间的差异，掌握辨别不同种类果蝇雌雄的方法，便于后期对处女蝇的挑选与雌雄果蝇的筛选和辨别。了解果蝇几种典型突变体黑檀体、残翅、三隐等个体的性状和表型，并与野生型之间进行仔细比较观察，准确地对突变体的性状进行识别，为进一步的杂交实验观察打下基础。学习和掌握果蝇培养的基本方法和操作步骤。2实验材料2.1实验材料2.1.1每一个学生体视显微镜一台；白色塑料板或硬纸板一张；小毛笔一只，杨氏解剖针一只，不锈钢尖头镊子一只，麻醉瓶(60ml广口瓶)一个，培养皿一个；移蝇塞2与移蝇漏斗各一个；吹气球或洗耳球一个；400ml或500ml冰袋两个。2.1.2每小组野生型果蝇(D.melanogaster)及突变体原种一套(装在一个塑料筐里)；滤纸条若干；2.1.3整个实验班培养瓶；海绵塞；配置培养基所需的药品；量杯；定量移液枪(量程15ml)及吸头；玻璃棒，小烧杯。2.2实验步骤2.2.1果蝇麻醉及其观察的方法选择亲蝇进行杂交或观察果蝇的性状，都要先将果蝇麻醉，使之处于不活动状态。采用冰袋麻醉法麻醉果蝇。在冰袋上放置麻醉瓶，轻拍麻醉瓶壁使果蝇掉落在麻醉瓶底部，等待果蝇完全失去活动能力，倒出到垫有滤纸的另一个冰袋上，滤纸可以沾少许水使其不到处移动。2.2.2果蝇的生活周期果蝇属完全变态昆虫，一个完整生活周期可分为卵、幼虫、蛹和成虫4个明显的时期。约10天即可产生一代。25时成蝇一般在交配一、两天后即开始产卵。雌蝇一天产卵可达100枚，一生可产约2000枚卵，卵长约0.5mm，白色椭圆形，前端背面有一对触丝使卵能覆在食物或瓶壁上。受精卵24小时内就可孵化成成幼虫，幼虫经两次蜕皮成为三龄幼虫。三龄期幼虫体长可达45mm，用肉眼观察可见其一端稍尖，上有一黑色勾状口器，幼虫生活4天左右开始化蛹。化蛹前三龄幼虫停止进食，爬到相对干燥的表面(如培养瓶壁)，逐渐形成一个菱形的蛹。从蛹壳中羽化出来的果蝇约12小时后即可交配4, 交配后精子可在雌蝇的受精囊中贮存一段时间，然后逐渐释放到输卵管中。所以，在杂交实验中母本必须选用未交配的雌蝇(处女蝇)。了解果蝇生活史可帮助我们有效控制果蝇杂交实验进程。例如，在杂交实验中亲蝇在培养瓶中培养的时间不得超过10天，否则将导致亲子蝇混杂。2.2.3雌雄果蝇鉴别黑腹果蝇的一个优势是雌雄蝇的一些表型特征区别明显，雌雄二态易于区分，对于实验者非常便利。雌雄蝇的辨别方法如下：大小 雌体通常比雄体大。形态 雌体腹部稍尖，较宽厚呈卵圆形；雄体腹部钝圆，相对于窄小呈柱状。条纹 雌体腹部背面有宽窄相近的5条黑色条纹；雄体腹背第5(A5)及A6上布满黑色素，与A4上的条纹连接在一起形成一条宽条纹，因此腹背看起来是上部两条窄下部一条宽且延伸至腹面的3条纹。性梳 果蝇腹足跗节共有5亚节。雌蝇第一对胸足跗节的第一二压节基部有一性梳妆黑色鬃毛结构即为性梳。放大100倍左右可看清这一结构。雌蝇没有性梳，不同种的性梳形态不同。性梳对雌蝇的成功交配起重要作用。雄蝇在交尾前用性梳抓牢雌性的腹部及生殖器，并展开翅膀2。性梳是鉴别雌雄蝇的可靠标志。外生殖器形态结构 这是本次实验重点观察内容之一。根据腹部腹面末端外生殖器结构来分辨雌雄已经是最简单可靠的方法，尤其是当果蝇刚孵化，性梳等特征不是特别明显时，外生殖器结构就成了十分有用的识别手段。因此同学们在观察时务必将蝇的外生殖器结构看清楚，这在收集处女蝇时非常有帮助，同时一些体色较深的果蝇(如黑檀体),利用背部条纹识别较为困难，此时用外生殖器结构进行识别是一个较容易的方法。简单来说，雄鹰色深，雌蝇外生殖器色浅。需要注意的是，刚孵化的雌蝇外生殖器的颜色较图示的浅。2.2.4突变性状的观察 基因及染色体的改变引起表型性状的改变。从表型上说，果蝇的突变性状主要集中在眼睛(颜色、大小、性状)，翅(形状，翅脉的无有及形态)，刚毛(有无、颜色、形态；刚毛是果蝇体表上较粗的毛)，体色，平衡棒(大小、形态)，触角这些方面，这也是本次实验观察的重点。辨明各种突变性状，有利于我们正确选择亲本，准确地识别杂交后代中的不同子蝇的表型。残翅果蝇对温度敏感，其翅会随着温度升高逐步伸长，30下能发育出与野生型一样的翅，25下有些个体翅也会伸长，不像典型的残翅了，不要误当成新突变或混杂。2.2.5果蝇的培养制备适合果蝇生长的培养基。在25时进行培养，24周换一次培养基，每一原种至少保留两瓶，每瓶接510对种蝇。培养瓶上注明原种名称、接种日期。过约一星期确认新接种的果蝇无污染、生长发育正常后再清洁原培养瓶。2.2.6处女蝇的收集黑腹果蝇接种后25下10天左右开始孵化，大约在第1316天羽化的果蝇数目最多，此后数量迅速减少。选择生长良好、含有较多即将羽化的蛹的培养瓶，清楚瓶中所有成蝇后放回培养箱，8小时内从瓶中收集到的雌蝇即为处女蝇。8小时内果蝇不会交配，可据此特性灵活安排收集的时间。一个杂交实验有510只处女蝇即可。处女蝇单独存放在一新的培养瓶内35天以检验其“处女性”，如瓶中出现幼虫则说明收集失败，需重新收集。刚孵化的幼蝇，体色很浅，体节上黑色条纹不明显，翅很短且卷曲，这种幼蝇据其腹尖腹面外生殖器形态可以清楚识别5。3结果与讨论3.1突变性状的显隐性及基因型表示方式表 1果蝇突变性状的显隐性及基因型表示方式突变性状黑檀体残翅小翅白眼焦刚毛表示方式ebony body,eevestigial wing,vgvgminiature wing,mmwhite eye,wwsinged bristle,sn3sn3显隐性显性隐性隐性隐性隐性表 2表示了实验中所选果蝇的性状的显隐性及其基因型表示方式。其中值得注意的是残翅果蝇，这个性状是温度敏感的，其翅会随着温度升高逐步伸长，30下能发育出与野生型一样的翅，25下有些个体翅也会伸长。3.2果蝇雌雄的辨别图 1为几种辨别果蝇雌雄的方法。图 2A为雌蝇的腹部图片，雌蝇腹部稍尖，较宽厚呈卵圆形，腹部背面有宽窄相近的5条黑色条纹；图 3B为雄蝇的腹部图片，雄蝇的腹部钝圆，相对窄小呈柱状，雄体腹面A5(黑色箭头所指)及A6(红色箭头所指)上布满黑色素，与A4上的条纹连接在一起形成一条宽条纹，腹面看起来像上部两条窄下部一条宽且延伸至腹部腹面的3条纹。图 4C为雌蝇胸足图片，雌蝇没有性梳，即第一对腹足跗节的第一亚节基部没有黑色状结构；图 5D为雄蝇胸足图片，雄蝇有性梳，即第一对腹足跗节的第一亚节基部有一梳状黑色鬃毛结构(图 6D红圈所示结构)。图 7E、图 8F分别为雌、雄蝇外生殖器结构(图中黄框所示)，雌蝇外生殖器较雄蝇外生殖器颜色较浅，雌蝇外生殖器较为光滑，而雄蝇外生殖器有很多毛状结构。ACEBDF图 9雌雄果蝇的辨别3.3突变性状的观察图 10A为残翅个体(图示为雌蝇)，残翅个体的翅相对野生型(图 11E)个体(图示为雄蝇)完整的翅，翅有残缺，基本只能看见翅基部。图 12B黑檀体个体(图示为雄蝇)，相对于野生型(图 13E)个体，黑檀体的体色为黑檀色。图 14C三隐个体(图示为雌蝇)，三隐个体眼睛颜色(黑色箭头所示)不同于野生型(图 15D)红眼，为明显的白色；体表刚毛(红色箭头所示)类型为焦刚毛，而野生型为直刚毛；翅相对野生型有所卷曲(黄色箭头所示)，表现为小翅。表 2对突变体及野生型的性状进行了汇总比较。ABCDE图 16突变体及野生型性状表 2突变体及野生型性状比较突变性状突变体眼睛翅型刚毛体色野生型红眼正常翅直刚毛正常残翅红眼残翅直刚毛正常黑檀体红眼正常翅直刚毛黑檀三隐性白眼小翅焦刚毛正常参考文献1 /genome/genomes/47?.2 Lindsley DL, Zimm GG. 1992. The genome of Drosophila melanogaster. San Diego: Academic press, Inc.3 Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans CA. et al. 2000. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Scien