第三章次级代谢产物的生物合成与调节ppt课件

.,1,内容回顾,提高代谢产物的基本思想代谢工程,.,2,2,第三章次级代谢产物的生物合成与调节,.,3,第一节微生物次级代谢产物的概念,.,4,初级代谢是为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，如蛋白质、核酸等的各种相互关联的代谢网络(包括分解与合成)。,一、初级代谢与次级代谢,.,5,次级代谢次级代谢的概念是1958年由植物学家Rohland首先提出的，它把植物产生的与植物生长发育无关的某些特有的物质称为次级代谢产物，合成与利用的它们的途径为次级代谢。1960年微生物学家Bu,Lock把这一概念引入微生物领城。主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌的生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常是在生长后期开始形成的。,.,6,二、微生物次级代谢的特点,1、次级代谢物有以下一些特征：种类繁多，结构特殊，含有不常见的化合物；如氨基糖、吲哚衍生物等含有少见的化学键，如-内酰胺环、大环内酯的大环等；一种微生物所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物,.,7,.,8,2、次级代谢产物合成的特点,次级代谢产物以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节例如：糖降解过程中的乙酰CoA是合成四环素、红霉素的前体；,.,9,乙酰CoA*33甲基3，5二甲基戊酸（MVA）异戊二烯焦磷酸，二甲基丙烯焦磷酸二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸（GGPP）*2八氢番茄红素六氢番茄红素胡萝卜素链孢红素番茄红素胡萝卜素胡萝卜素海胆酮胡萝卜素胡萝卜素角黄素隐黄质叶黄素虾青素玉米黄素环氧玉米黄素辣椒红素紫黄素辣椒玉红素新黄素类胡萝卜素的生物合成途径,.,10,次级代谢酶的专一性低,相对来说催化初级代谢产物合成的酶专一性强，催化次级代谢产物合成的某些酶专一性不强，因此在某种次级代谢产物合成的培养基中加入不同的前体物时，往往可以导致机体合成不同类型的次级代谢产物。,.,11,次级代谢产物一般都在菌体的生长后期合成次级代谢则是在菌体生长到一定时期内（通常是微生物的对数生长期末期或稳定期）产生的，它与机体的生长不呈平行关系，一般可明显地表现为菌体的生长期和次级代谢产物形成期二个不同的时期。,.,12,.,13,次级代谢产物的合成时期可因培养条件的改变而改变，在天然培养基中，氯霉素菌体生长后期合成，而在合成培养基中，它的合成与生长平行。,.,14,同种微生物的不同菌株可以产生分子结构不同的次级代谢物，如灰色链霉菌可生产链霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰绿霉素和灰争霉素等，不同种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物，如产黄青霉、点青霉、土曲霉、构巢曲霉、发癣霉属的一些真菌都能产生青霉素,次级代谢产物的合成具有菌株特异性,.,15,如生长可在0.3300mmol/L磷酸盐浓度下进行，而次级代谢物合成的最适浓度只在0.1-10mmol/L范围,次级代谢产物的合成比初级代谢对环境因素更敏感,.,16,次级代谢与质粒的关系,把菌体放在含有一定浓度质粒消除剂培养基中振荡培养，然后把经培养生长的菌丝涂平板，长出菌落后，测定各菌落产生抗菌生素的能力，结果不产抗生素的菌落出现率为2.7%-54.5%，对照组，不产抗生素的菌落出现率为5-7%,.,17,质粒含有抗生素的结构基因质粒含有合成抗生素的调节基因质粒含有控制抗生素的分泌的相关基因质粒含有对所产生的抗生素的耐性基因,.,18,三、次级代谢产物的类型,由葡萄糖直接合成的次级代谢产物如曲酸，链霉素，大环内酯类抗生素的糖苷由预苯酸合成的芳香族次级代谢产物如氯霉素，新霉素，磷酸五碳糖合成的次级代谢产物如嘌呤霉素，多氧霉素,1、由糖或糖的衍生物为前体合成的次级代谢产物,.,19,2、利用氨基酸等作为前体合成的次级代谢产物,由一个氨基酸形成的次级代谢产物环丝氨酸，氮丝氨酸由两个氨基酸形成的曲霉酸以三个或三个以上氨基酸缩合以肽键结合而成的次级代谢产物放线菌素，杆菌肽,.,20,3、通过乙酸丙二酸聚合途径合成的次级代谢产物,四环素，红霉素，放线菌酮，利福霉素,4、通过莽草酸或分支酸合成途径合成的次级代谢产物,新生霉素，绿脓菌素，吲哚霉素,5、通过甲羟戊酸与异戊二烯聚合途径合成的次级代谢产物,类固醇、赤霉素,.,21,四、次级代谢物的生物合成过程,养分的摄入通过中枢代谢途径养分转化为中间体小分子建筑单位的生物合成如有必要，改变其中的一些中间体这些前体进入次级代谢物生物合成的专有途径对主要骨架进行最后修饰，成为最终产物,.,22,营养物质（CNPS等）,初级代谢,前体,次级代谢产物,聚合、结构修饰、装配,.,23,第二节、次级代谢的调节,次级代谢产物的种类在不同的微生物中非常不同，次级代谢途径远比初级代谢复杂，代谢调节类型的多样性就可想而知。,前体的作用营养期(生长期)-分化期(生产期)的关系酶的诱导反馈调节分解代谢物的调节能荷调节避开次级代谢的调节,.,24,一、前体的作用,定向发酵：对任何一项发酵工艺，培养基的筛选常常要检验成百种添加物，看可否作为前体，偶而发现一些前体可促进次级代谢物的合成，或者形成特定产物。这通称为定向发酵。如苄青霉素发酵的苯乙酸，放线菌素类和短杆菌酪肽合成中的特种氨基酸均可作为前体。,.,25,放线菌素D,.,26,.,27,前体的作用：,起次级代谢物的建筑材料作用诱导抗生素生物合成的作用丙醇能诱导红霉素链霉菌的乙酰CoA羧化酶细胞毒性,.,28,二、营养期(生长期)-分化期(生产期)的关系,次级代谢的一个特征是次级代谢物通常不在迅速生长阶段(营养期)内形成，而在随后的生产阶段(分化期)合成。,次级代谢物的形成出现较迟，这或许是抗生素产生菌避免自杀的主要机制之一。在营养期大多数微生物对它们自己产生的抗生素是敏感的，只有到了分化期它们对自己合成的抗生素才在生理上获得耐受力。,次级代谢产物合成迟后的原因主要是合成次级代谢产物的酶在生长期受到阻遏作用。,因此次级代谢产物的形成是在某些养分从培养基中耗竭时开始的。易利用的糖，氨(NH3)或磷酸盐的消失导致次级代谢物的阻遏作用的解除。在生长末期细胞内酶组成发生显著变化，负责次级代谢产物合成的酶突然出现。表4-1列出了生长期末被去阻遏的一些重要的酶。,.,30,三、酶的诱导,前体或其结构类似物的诱导作用：色氨酸在麦角生物碱生物合成中是一个前体，它对生物碱合成酶有诱导作用。色氨酸结构类似物也促进生产。甲硫氨酸具有促进抗生素生产的作用。在顶头孢霉的头孢菌素C生物合成中。虽然甲硫氨酸经半胱氨酸给头孢菌素C的合成提供硫，但其促进抗生素的合成作用似乎是诱导在起作用。,.,31,利福霉素产生菌诺卡氏菌经42高温处理或长期保存在琼脂上可分离到不产利福霉素的突变菌株，其中有些甚于不能形成气生菌丝，在此类不产利福霉素的突变菌株培养液中加入酵母抽提物会恢复合成利福霉素，从酵母抽提物中分离到对利福霉素的生物合成具有激活作用于的诱导物，是一种腺苷衍生物。,.,32,前体或其结构类似物一般在生长期后加入才有效，在生长期内加入无多大效。在生长期内添加的色氨酸很快被消耗掉，而在生长期末色氨酸在胞内的浓度比生长旺盛期高2至3倍。,.,33,四、反馈调节,青霉素生物合成受L-赖氨酸的反馈抑制。,赖氨酸一个中间体，-氨基己二酸，参与青霉素生物合成。赖氨酸对其本身的生物合成的第一个酶(高柠檬酸合成酶)的反馈抑制作用限制了-氨基已二酸的生成，从而间接地抑制青霉素的生物合成。因而如向青霉素发酵加入-氨基己二酸，可减少赖氨酸的抑制作用。,.,34,芳香族氨基酸抑制杀假丝菌素的生物合成，这些氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)是对-氨基苯甲酸(杀假丝菌素、氯霉素的一个前体)的分枝途径的终点产物。因而对早期共同途径的一个酶的负向反馈调节，会阻遏杀假丝菌素、氯霉素的形成。,.,35,.,36,产物调节作用氯霉素阻遏第一个酶芳基胺合成酶卡哪霉素阻遏乙酰基转移酶霉酚酸抑制合成途径最后一个转甲基酶嘌呤霉素抑制O-去甲基嘌呤霉素菜甲基转移酶,.,37,五、分解代谢物的调节,分解代谢物调节作用实际上是从抗生素发酵中观察到的。在1940年青霉素发展的早期阶段，就已发现可迅速利用的葡萄糖是青霉素生产的低劣基质。而乳糖被缓慢利用，对青霉素形成非常有利。在含有葡萄糖和乳糖的培养基里，葡萄糖在生长期内被迅速利用。当葡萄糖耗竭时，便开始利用乳糖。在乳糖缓慢利用期间，生长进入稳定期，并合成抗生素。,.,38,乳糖并不是青霉素生物合成的特异性前体，它的价值在于缓慢利用。今日的青霉素工业已采用缓慢补加葡萄糖的办法代替乳糖。限制葡萄糖在发酵中的浓度可使分解代谢物处在一低水平。,在葡萄糖与乳糖中青霉素代谢发酵曲线,.,39,其他分解代谢物的调节现象,有许多其他品种的发酵也受葡萄糖的阻遏，因而采用其他碳源。葡萄糖抑制麦角生物碱、头孢菌素C、螺旋霉素、紫色杆菌素、嘌呤霉素、吲哚霉素、灵菌红素、盐屋霉素、丝裂霉素、杆菌肽、新生霉素、放线菌素和香豆霉素的形成。在含有柠檬酸和葡萄糖的培养基里进行新生霉素发酵，柠檬酸首先被利用，只有在柠檬酸耗竭和出现二次生长时才开始利用葡萄糖和形成新生霉素。,.,40,氮代谢物的调节,氮源的种类和浓度的变化，对于次级代谢物的产生与积累也有很大影响，与碳降解物调节作用类似。一般能被迅速吸收利用氮源如氨，硝酸盐和一些氨基酸对抗生素的产生和积累有抑制作用。当培养基中这类氮源几乎被耗尽才开始产生与累积次级代谢物。氯霉素，利福霉素等,.,41,如何解除这种分解代谢物调节？,.,42,六、能荷调节（磷酸盐的调节）,磷酸盐影响金霉素的合成。当培养液中的磷酸盐耗竭后才进入生产期。因金霉素的合成没有磷酸化这一步。磷酸盐通常不是通过磷酸酯酶的负向反馈调节起作用的，而是通过高能荷抑制抗生素的合成。ATP含量在生长期内增加，在金霉素形成期降低并保持在低的水平。高产突变株的ATP含量只有低产亲株的25%-50%。,.,43,外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输，如发生障碍，则胞内合成代谢物不能分泌出来，影响发酵产物收获，或胞外营养物不能进入胞内，也影响产物合成，产量下降。在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。如果输入硫化物能力增加，硫源供应允足，合成青霉素的量就增多。,七、细胞膜透性的调节,.,44,八、提高次级代谢物的产量,1、操纵环境条件可控制许多次级代谢物的生物合成。（1）加入诱导剂或前体在生物碱发酵中加入诱导剂-色氨酸；（2）限制磷酸盐的量（3）避免分解代谢物对生物合成酶的阻遏青霉素发酵中避免使用可迅速利用的糖，如葡萄糖(若要使用，宜缓慢补入)。,.,45,2、改变微生物的遗传性质（突变），每一种调节机制都是由遗传决定的，通过诱变可提高菌种合成次级代谢物的能力。抗生素生产从它们的发现到今日提高了100到1000倍，突变的功劳最大。（1）筛选营养缺陷型回复突变株通过突变除去一种酶，再用第二次突变置换它(回复)。常获得耐反馈调节的突变株。有人通过突变使营养缺陷型失去生产金霉素前体一甲硫氨酸的能力，然后通过回复突变获得高产金霉素产生菌。（2）筛选耐高浓度代谢产物的菌株次级代谢物本身是生长抑制剂，则可将此抗生素用于筛选耐药性菌株，并从中获得高产菌株。,.,46,八、次