第十一章电泳和电色谱ppt课件

.,1,第十一章电泳和电色谱,electrophoresisandelectrochromatography,.,2,生物分离过程的一般流程,原料液,细胞分离(离心，过滤),细胞胞内产物,路线一,路线二,细胞破碎,碎片分离,路线一A,路线一B,清液胞外产物,粗分离(盐析、萃取、超过滤等),纯化(层析、电泳),脱盐(凝胶过滤、超过滤),浓缩(超过滤),精制(结晶、干燥),包含体,溶解(加盐酸胍、脲),复性,电泳(Electrophoresis)荷电溶质(电解质)或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象，简称EP。电泳分离利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。,概述,带电粒子在电场作用下向着与其电性相反的电极移动,电泳与色谱技术的比较,共同点：表象上均为溶质移动速度差异而分离不同点：产生溶质移动速度差的原理不同。色谱为浓差驱动的传质平衡分离法电泳是外力(电场力）作用下的差速分离法,电泳与色谱技术的结合电色谱,电泳色谱:将溶质的电动迁移和色谱分离作用相结合的技术电色谱：利用电渗作用驱动流动相流动，依据溶质在固定相和流动相的分配行为差异进行分离一般情况下，二者并无严格区别，均称为电色谱,电泳法的发展20世纪初期已用于蛋白质的分离70年代前，主要应用于分析目的70年代后，分离制备规模90年代后，毛细管电泳和电色谱用于高速分析和微量分离制备,电泳法的特点：（1）分辩率高,属高度纯化技术（2）电场作用（3）设备放大难，多用于分析（实验室应用）,电泳技术的分类根据原理和操作形式可分为：区带电泳等电点电泳等速电泳根据是否使用凝胶载体可分为：凝胶电泳(Gelelectrophoresis)自由流电泳(Freeflowelectrophoresis),以琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。,在无固相支持介质,用特定缓冲液作为分离介质的分离系统中所进行的可溶性分子或不溶性颗粒的电泳分离纯化技术,按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为:(1)板式电泳：水平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。垂直板式电泳：支持物垂直放置(2)柱式电泳：采用圆柱形凝胶柱，电泳分离后可将凝胶切片，回收组份，多用于制备,电泳的应用：1、分离各种生物产物：如蛋白质、酶、核酸等2、分析某种物质的纯度及分子量,第一节基础理论,一、自由溶液中的电泳速度,U0为迁移率(mobility)：单位电场强度下带电粒子的泳动速度,当f=f时，荷电溶质恒速泳动，则,考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率为,静电引力f=EZe,黏性阻力f=6e,或e=u0E,U0=eZ/6r,kr为粒子半径与双电层厚度的比值,Z溶质电荷数E-电场强度电子电量,r球形溶质半径,溶液粘度Ve溶质运动速度,二、凝胶中的电泳速度,凝胶电泳的优点可避免或减小因对流或热扩散引起的分离度降低(较自由流电泳分离度高）；凝胶本身具有分子筛的作用，有利于提高电泳分离度。凝胶电泳的缺点凝胶载体对溶质泳动产生的阻力影响电泳速度，并且耗电量大，处理量较小,常用的凝胶载体聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖、淀粉（易发生电渗流，造成分离度下降）,聚丙烯酰胺凝胶电泳速度,Lgu=lgu0-KrTg,Uo为自由溶液中的迁移率Kr为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数Tg为凝胶浓度,由丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺共聚而成,三、电渗流速度,电渗流的概念琼脂糖等凝胶载体在电场作用下易电离带负电荷，其诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向泳动（向阴极移动），并带动周围的溶剂（水）化层一起泳动，并在摩擦力作用下，带动主体溶液一起移动的现象电泳淌度：单位电场强度下带电粒子的泳动速度,电渗流驱动的电色谱的流速,流速与操作压力无关，即电渗流不会引起色谱柱压力的增大电渗流速度与固定相粒径无关，电色谱可采用比HPLC更小的固定相粒子（1.5-5m),电渗流速度公式,HPLC常采用固定相粒径5,E电场强度介电常数V0电渗流速度,wZeta电位,L电渗淌度,四、影响电泳迁移速度的因素,样品性质电场强度缓冲液的性质电渗温度,(1)样品性质：带电量，分子大小，形状分子带电量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快(2)电场强度：电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快过高，产热，样品和Buffer扩散增加，条带增宽，蛋白变性。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时（如高压电泳），需附有冷却装置,(3)缓冲液的性质a缓冲液的pHpH决定带电量，(pH-PI)越大，带电量越多，迁移速率越大b离子强度I越大，样品电流减小，迁移率变小；I越小，样品电流越大，迁移率越大，但样品易扩散，一般I在0.02-0.2M,选择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差异较大，利于彼此分开；电泳过程中须采用具有一定缓冲能力的缓冲液使pH值恒定。,(4)电渗当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。,（5）温度：过高，由于产热增加、水分蒸发，对电泳不利。,第二节凝胶电泳,利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。是区带电泳分离法,一、凝胶电泳原理,凝胶电泳与凝胶过滤的区别：凝胶电泳：样品中各分子的运动速度是小分子快于大分子凝胶过滤：大分子运动快于小分子原因：凝胶电泳中,系统里没有空隙体积,只有网状骨架。大分子物质不及小分子物质容易移动。,1.板式凝胶电泳处理量很小，不适合生物产物的分离制备。,水平式平板凝胶电泳,垂直式平板凝胶电泳,凝胶电泳的类型,2.圆柱型凝胶柱凝胶切成圆片，分别溶出各个组分。缺点：操作过于繁琐，回收率不高，且易变性,优点：操作简便，凝胶可重复使用。缺点：回收的溶质浓度很低。,连续洗脱凝胶电泳：当溶质泳动到凝胶末端时，通入洗脱液分别回收各个组分。,根据溶质的相对分子质量选择7.5的聚丙烯酰胺凝胶孔径较小，适用于相对分子质量为10kD1000kD的溶质的分级分离；3.5的聚丙烯酰胺凝胶孔径较大，适用于相对分子质量为1000kD-5000kD的溶质的分级分离聚丙烯酰胺与琼脂糖的混合凝胶，或纯琼脂糖凝胶孔径更大，适用于分离相对分子质量更大的溶质。核酸的分离通常采用0.5-1的琼脂糖凝胶,凝胶种类和浓度,凝胶电泳操作步骤,制胶或染色时加入的染料EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,M1234,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳,由浓度不同的两层凝胶组成:浓缩层和分离层上层凝胶：浓缩层凝胶浓度较低(丙烯酰胺浓度为23Tg)，孔径较大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质以等速电泳的形式泳动，得到浓缩。下层凝胶：分离层凝胶浓度较高(525Tg)，各个组分根据迁移率的差别得到分离。,二、不连续凝胶电泳,不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。,不连续电泳的三个不连续性：a.凝胶浓度的不连续性(分离胶浓度浓缩胶）b.缓冲液pH值的不连续性c.缓冲液离子成分的不连续性,不连续电泳的不连续性,浓缩层凝胶缓冲液为pH6.8的Tris-HC1；分离层凝胶缓冲液为pH8.9的Tris-HC1；电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸-HC1缓冲液。,蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素,电荷因素分子大小分子形状,分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同,分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同,分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，迁移率取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate,简称SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,等速电泳的特点(1)各个组分间形成相互连接的独自区带，可有效抑制扩散引起的区带分散现象。(2)提高前导电解质浓度，可提高溶质的浓缩率。(3)采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。,应用：主要用于成分分析，在物质的分离回收方面应用极少。缺点：每个区带互相连接，回收困难。电泳装置的散热问题难于解决。,分离操作及其特性1.分离操作以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白质的等电点(pI)选定。2.分离特性选择适当的操作条件，可进行各种蛋白质的分离。调节pH值可改变荷电量Z调节凝胶浓度可改变迁移率（适当的Tg可缩短分离时间，提高分离效率）调节电压可改变电泳速度等（需考虑设备散热能力，E不能过大）,第三节等电点聚焦(Isoelectricfocusing，IEF),IsoelectricFocusingElectrophoresis，IEFE,定义：一种利用具有连续pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。,等电聚焦电泳,一、等电聚焦（IEF)的原理,在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由正极到负极逐步增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。蛋白质（和氨基酸）等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，不发生泳动。因此，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相应的等电点位置上，形成具有不同等电点的蛋白质区带,pI1pI2pI3pIn,-,+,蛋白质分子的等电聚焦过程,进行IEFE必须具备3个条件：,有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的连续pH梯度有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带,连续pH梯度的调配采用载体两性电解质聚氨基羧酸为缓冲液特点：聚合物含有许多正负电荷，并且与蛋白质的等电点范围相同，缓冲能力强，pH梯度较稳定，商品化载体两性电解质有Ampholine等。该产品一般有三种pH梯度范围，如pH46、pH810和pH911等。,凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）,加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布,等电聚焦示意图,（一）优点1.分辨率高分辨率较不连续PAGE更高（精密度可达0.01pH单位，灵敏度高，最低检出量达0.1ng）。2.重复性好。,二、IEFE的特点,可消除分子扩散引起的分离度下降，电泳区带相当狭窄。特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。,（二）缺点1.载体两性电解质污染产品2.pH梯度的稳定性不高3.操作过程中易发生凝胶起皱脱水现象4.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不溶或发生变性的蛋白质。,第四节二维电泳Two-dimensionalelectrophoresis,定义同时利用分子的大小和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通凝胶电泳和IEF相结合，因此分离效率更高。,原理：在凝胶电泳槽的y方向上凝胶具有浓度分布(逐渐增大)，而在x方向上具有pH梯度（1）首先在x方向上调配pH梯度