启动子ppt课件

启动子研究初探讨,2012.11.22,1,启动子：一段能被RNA聚合酶特异性识别和结合，能正确有效的起始转录的一段DNA调控序列，一般位于基因5端上游区域。真核生物具有三种RNA聚合酶，而RNA聚合酶型启动子在真核生物中最为常见，也最为复杂。有多复杂？比如，有包括TATA框、GC框等多种元件；比如存在远端调控序列；比如通过多种转录因子间接与RNA聚合酶结合。,一.启动子相关介绍,1.1启动子的概念,2,启动子是在DNA转录为RNA这一步过程中发挥作用的，在此要与DNA自身复制起始点（称作复制子）和由mRNA翻译为蛋白质时的翻译起始点（以起始密码子ATG为标志）区别开来。,3,4,传统的启动子理论认为人类每个基因平均拥有约一个启动子且启动子上供读取信息的起始点只有一个、一个启动子只能转录出一种RNA。然而，来自日本理化研究所等机构的研究人员近日在自然遗传学杂志上发表论文说，他们分析了约1400万条RNA链，并以此为线索研究这些RNA链是从DNA的哪个部位开始转录而成的。研究人员在此基础上确定，人类DNA拥有的启动子数量超过19万个，平均每个基因至少有5个启动子。,1.2启动子的认识,5,研究人员还发现，即使是同一个启动子，根据读取遗传信息的起始点不同，转录出的RNA种类也存在差异。研究显示，拥有多个起始点的启动子约占启动子总数的77%。或两种以上的顺式元件，这些元件的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响基因的转录与否或转录程度。,6,核心启动子：RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位。分为集中型和分散型。在集中型转录起始作用里，基因转录从一个或很少几个核苷酸位点处开始；而在弥散型转录起始作用里，在一段长约50-100bp的“广阔范围”里会同时存在好几个转录起始位点，不过每一个转录起始位点的转录起始作用都比较弱，有一些启动子同时具有这两种转录起始作用。,1.3核心启动子的介绍,7,集中型启动子可见于所有生物体基因组内，在较低等的生物体内这种转录起始作用几乎是唯一的一种基因转录起始机制。不过在脊椎动物体内，大约有70%的基因都受到弥散型启动子的控制，这些基因常见于CpG岛内。一般来说，集中型启动子主要见于受调控基因（regulationgene）,而弥散型启动子多见于组成型基因（constitutivegen）。,1.3.1核心启动子的分类,8,虽然在脊椎动物启动子中集中型启动子只占很小的比例，但绝大部分对RNA聚合酶转录机制的研究都是在集中型启动子上开展的，很少有人关注弥散型启动子，这主要是因为受集中型启动子调控的基因在生物学中具有更加重要的意义。科学家们通过对集中型核心启动子（corepromoter）的分析发现了各种重要的基序，比如TATA盒、BRE”位于TFB”因子识别位点上游的一段序列、起始子、基序十元件（MTE）、下游启动子元件（DPE）、下游核心元件(DCE)以及X核心启动子元件1（XCPE1）等。与集中型启动子不同，弥散型启动子一般都缺乏BRE、TATA、DPE和MTE等基序。所以这两种启动子发挥作用的原理很有可能存在根本性的差别。,1.3.2核心启动子中重要元件,9,图1：核心启动子机制图,弥散型核心启动子往往只含有集中型启动子部分的核心元件，没有固定的核心元件及核心调控模式，其调控模式比集中型要复杂得多。,10,图2.分散型核心启动子机制,11,研究启动子的意义：研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制的研究具有十分重要的意义，能使外源基因高效，准确，长期稳定地在目的部位表达的启动子序列是基因治疗和基因工程研究的热点之一。,1.4研究启动子的意义,12,二启动子区域的查找以及分析,2.1克隆全长启动子2.1.1利用数据库查找所要研究的启动子。通常情况下，我们认为启动子区域在基因翻译起始位点ATG往前大约2000bp。根据研究，有些重要的调控元件也存在于第一外显子内，一般在ATG的下游再取200bp。首先介绍利用NCBI数据库进行查询。,13,14,15,41640324代表ATG所在的位置,16,17,18,应用UCSC/Ensembl查找基因启动子(promoter),网址：,19,20,21,2.2启动子的甲基化预测,CpG岛(CpGisland)：CpG双核苷酸在人类基因组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛,在哺乳动物基因组中的1-2kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。CpG岛主要位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超过200bp。CpG岛经常出现在真核生物的house-keeping基因的调控区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成5-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在基因组中是以岛的形式分布的。,22,CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG对很少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子（promotor）或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作CpG岛。CpG岛所在的位置，有可能是核心启动子存在的区域。预测网站/cgibin/methprimer/methprimer.cgi,23,24,红框内为预测的CpG岛，在进行缺失实验时，可以保留此区域的完整性。,25,3缺失片段的构建,1利用文献中报道的顺式作用元件和转录因子进行缺失；2利用物种之间一些保守的模块或基序对启动子进行缺失。,26,3.1顺式作用元件的预测,得到启动子序列后,克隆进没有启动子载体pGL3或者pTAL-luc中去，转染细胞,测定荧光活性，如果有很强的活性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子然后可以通过5非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找到一段最短且具有基本调控功能的启动子区域。可以通过一些顺式作用元件的预测对启动子进行缺失。利用在线的软件预测顺式作用元件的位点,每个在线软件都有自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的,每个软件都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分析预测出来的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做进一步的选择，继续做下面的验证实验。,27,下面为免费预测网站：http:/www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html/cgi-bin/tess/tess,以TESS为例预测转录因子,3.1.1转录因子的查找,28,同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的相关信息。,29,1.EMSA实验在体外验证顺式作用元件同反式作用因子的结合反式作用因子一般指的就是转录因子,顺式作用元件一般是指转录因子和启动子结合的那部分序列,一般是10-20bp左右.点突变证实该顺式作用元件对于启动子活性是有影响的,接下来就要用EMSA实验验证反式作用因子和该顺式作用元件在体外是有直接结合的,反式作用因子可以用细胞核抽提物做，也可以用体外表达纯化的蛋白，也可以用该反式作用因子的抗体做Supershift实验，进一步证实该证顺式作用元件同反式作用因子的特异性结合。,3.1.2转录因子的验证,30,2.CHIP实验在体内验证顺式作用元件同反式作用因子的结合当EMSA实验得到阳性结果后,还是不能最后肯定该反式作用因子和该顺式作用元件有结合.毕竟体外的结合并不能代表生理条件下的结合.接下来就要用染色质免疫沉淀(ChIP)技术来证实在体内的生理条件下该顺式作用